实时荧光定量PCR技术(Real-time Quantitative PCR,qPCR)是指在PCR反应体系中加入可与DNA产物特异性结合的荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最终通过相对定量或绝对定量的方法确定各个样本的本底表达量。微生物QPCR可用于快速、准确地测定目标微生物数量。
真核生物常见内参:18S rRNA、β-actin、GAPDH、EF-1α等;原核生物:16S rRNA、gyrB等。如果无法确定内参,建议参考文献,或者做内参筛选实验。
引物和探针的选择需要考虑到目标微生物的特异性和保守性。可以使用公开可获得的微生物基因数据库,如NCBI,进行引物和探针设计。此外,确保引物和探针的互补性和避免引物之间的重叠和相互作用也很重要。