ATAC-seq（染色质转座酶可及性测序）是一种高效解析染色质开放区域的技术，通过Tn5转座酶靶向切割松散染色质并标记DNA，结合高通量测序揭示基因调控元件的位置与活性，在植物生理研究中也被广泛应用。例如，ATAC-seq联合RNA-seq和Ribo-seq，揭示茶树通过染色质重塑协同转录与翻译适应低温的分子策略；此外，该技术还用于拟南芥光信号响应研究，揭示BAF60蛋白通过竞争结合开放染色质区域调控光形态建成的分子机制等。

本次为各位老师带来华中农业大学邓秀新教授团队在Plant Journal中发表的研究论文，题目为“Adventitious embryonic causal gene FhRWP?regulates multiple developmental phenotypes in citrus reproduction”，该文章利用ATAC-seq和转录组技术，探究了柑橘中无性繁殖现象——不定胚发生的机制。百迈客生物为该研究提供了ATAC-seq测序服务。

研究背景

植物的再生和发育是一个关键的过程，涉及从组织、器官、愈伤组织甚至具有多能性或多能性的单个细胞中重建整个植物，并通过复杂的调控网络进行细胞命运的转化，深入了解植物的再生和发育，对于设计提高作物再生效率的分子工具至关重要。

不定胚直接从获得胚性命运的珠心组织细胞亚群发育而来，作为有性生殖的替代品，在柑橘和芒果等少数植物中已有报道，因此，对不定胚胎发生的研究可以为植物再生和发育的遗传机制提供独特的视角；由于缺乏合适的遗传系统来探索潜在机制，我们对不定胚和再生之间关系的理解非常有限，在植物再生工程应用中，目前已有部分基因被鉴定并用于促进植物再生，从而克服了与物种相关的局限性，FhRWP的功能和不定胚的调节网络仍在很大程度上未被了解，已有研究提出，染色质重塑复合体亚基?被认为能够诱导FhRWP的高表达，该研究通过整合转录组与染色质开放图景数据阐明了FhRWP表达与其表观遗传调控之间的调控关系。

材料及方法

材料：单胚基因型和多胚基因型山橘胚珠、腋芽、幼叶及胚源性愈伤组织等；

方法：ATAC+转录组+重测序+激素检测等

研究结果

1.多胚山橘的开放性染色质

为了揭示来自珠粒细胞的外胚的重编程模式，作者采用ATAC-seq分析了多胚（PO）及单胚（MO）基因型山橘后胚的胚珠的全基因组染色质可及性，结果表明，PO特异性开放染色质区域（ACRs）基因参与了次级代谢过程、生长正调控、细胞分化和正向调控细胞生长。

先前的研究表明，一个显性基因FhRWP决定了与微型倒重复转座因子（MITE）插入相关的不定胚胎的启动，在PO基因型中FhRWP的启动子区中鉴定到了特异性ACR，而Mo基因型中不含ACR，该ACR与FhRWP启动子区域的MITE序列重叠，即MITE序列被FhARID1蛋白结合，这可能是染色质重塑复合体的一个亚基，这些结果表明，FhRWP是可及染色质的决定因素，参与不定胚胎发育，与MITE的插入有关。

山橘基因组中与组织再生和体细胞胚胎发生相关的hub基因，研究结果表明，与组织再生和体细胞胚胎发生相关的hub基因，有12个ACRs特异性转录因子在PO和Mo基因型柑橘品种之间存在差异表达，WUSCHEL（WUS）基因是干细胞维持的关键调控因子，在PO基因型柑橘中表达上调。FhKRP7kip相关蛋白（KRP）基因编码一种细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂（CKI），是细胞分裂的负调控因子。而FhKRP在PO基因型中下调了0.59倍。总的来说，分析显示，多胚胎基因型可能具有更大的染色质可及性区域，促进植物重编程通路相关基因来调控不定胚的形成。

2.FhRWP基因的基因编辑结果展示其在不定胚发生中的作用

FhRWP基因在胚囊中的表达是特异性和短暂的，可以从受精前7天开始追踪，直到后10天，作者采用RNAi方法构建了6个干扰系，发现FhRWP在6个干扰系中的表达量相比PO系显著降低，但显著高于Mo基因型，且FhRWP表达量降低后不定胚数量也都减少了，这些结果提示，受FhRWP控制的不定胚表型可能与基因表达的剂量效应有关。

作者之前的研究显示的杂合子插入MITE启动子区域和一个FhRWP的CDS序列区域SNP（C-G），导致这个基因的分裂成两个单倍型，M等位基因（MITE）和P等位基因（没有MITE）。根据Mo和PO腋芽的转录组结果，作者发现PO中RWP转录本高表达P等位基因，而Mo中M等位基因表达较小，于是作者构建了CRISPR/Cas9载体，以敲除FhRWP，结果表明，插入MITE可以通过促进含有MITE的P等位基因的表达，同时减少不插入MITE的M等位基因的表达，从而改变该基因的表达模式。虽然FhRWP在ko-47-1和ko-47-2中的FhRWP的表达下降到与Mo一致的水平，但P等位基因突变导致的过早终止导致了FhRWP功能的丧失，因此，ko-47-1和ko-47-2植株表现出新的表型，如生长迟缓和花芽分化失败。

此外，对对照和转基因株系的腋芽进行差异表达分析发现，这些基因在确定植物器官特性和植物器官形成等过程中存在明显的富集，与开花相关的FT/TFL1基因家族的表达也存在差异；此外，有研究表明CEN促进了芽的休眠作用，通过酵母单杂交，发现FhRWP直接调控FhCEN的启动子区域。

柑橘胚愈伤组织的诱导具有明显的基因型依赖性，作者在Mo基因型山橘中过表达FhRWP的P等位基因CDS，检测到GFP的植株胚胎愈伤组织增长迅速。qRT-PCR显示FhRWP表达高度上调，细胞分裂素、ABA和水杨酸激素水平有显著变化，而生长素和赤霉素水平则无显著性差异，FhRWP的过表达有助于Mo基因型山橘茎段上胚胎愈伤组织的形成。转录组结果显示，WUS和CLV1等再生途径相关的低丰度基因表达上调，在OE-FhRWP愈伤组织中，WUS与CLV1表达量增加，与激素分析结果一致，与ABA和细胞分裂素合成途径相关的基因，包括IPT、CKK、AHK、PYL的表达存在显著差异。

3.FhRWP在柑橘多种组织繁殖中的多效性

多项实验结果表明，FhRWP在协调细胞命运和启动植物再生和繁殖过程中起着关键作用，因此，该研究对腋芽MO/PO胚珠的表达数据进行了整合的转录组分析。差异基因在花器官发生和繁殖相关的生物过程显著富集，其中来自MADS和WOX等基因家族的转录因子，包括FhWUS和FhAGL6，均显著富集，在过表达的愈伤组织中，共鉴定出354个差异表达的转录因子，GO注释显示与胚胎后发育和再生相关的过程显著相关。值得注意的是，属于GRF和TALE等基因家族的转录因子，包括FhAHT1和FhGRF1，表现出显著的富集，这些基因已被广泛报道参与光形态建成、叶片发育等信号通路。

同时，作者在Mo和PO胚珠中发现了56个差异表达的转录因子，它们与分生组织维持和胚胎后发育相关的过程显著相关，其中，来自NAC、NAC等基因家族的转录因子，包括FhNAC等转录因子显著富集。此外，还发现了另一个与柑橘核细胞胚发育密切相关的转录因子FhC2H2，这些基因参与了伤口的愈合、再生和繁殖，研究结果表明，FhRWP可能是一个关键的调控枢纽，通过调节下游转录调控网络和影响各种组织来影响植物的再生。

思路发散

该研究从ATAC-seq入手，先从特异性及差异开放区域相关基因中筛选出来部分目的基因，再结合转录组基因表达以及大量基因编辑逐步完善FhRWP调节柑橘繁殖中的多效性，与直接从转录组入手筛选基因相比，初筛的基因范围可能会更小，更利于进一步锁定关键基因，为后续其他研究提供了新的思路。

参考文献：

Song X, Wang N, Zhou Y, Tian X, Xie Z, Chai L, Wu X, Xu Q, Zhang F, Ye J, Deng X. Adventitious embryonic causal gene FhRWP regulates multiple developmental phenotypes in citrus reproduction. Plant J. 2024 Aug;119(3):1494-1507. doi: 10.1111/tpj.16870. Epub 2024 Jun 16.