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Pacbio全长转录组测序

全长转录组研究是理解生物机体功能的一个重要途径。传统二代转录组测序无法直接获得单个RNA分子由5ˊ到3ˊ的全部序列。基于PacBio三代测序平台的转录组研究，无需打断，直接读取反转录的全长cDNA,能够有效的获取高质量的单个RNA分子的全部序列，准确辨别二代测序无法识别的同源异构体（isoform）、同源基因、超家族基因或等位基因表达的转录本。

?分析内容

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?结果展示

ccs

CCS数据展示

PacBio测序仪每个cell含有ZMWs，reads进入ZMW孔中被测序，一个ZMW中含一条的reads（P1）为有效数据。通过有效数据的子序列获得一致序列即为每个单分子测序反应器ZMW的CCS序列。CCS序列是每个单分子测序反应器ZMW里插入序列的最高质量序列。CCS序列可以从一定程度上评估建库质量和SMRT? Cell上样时序列的长度。

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全长转录本数目统计

通过检测CCS序列中是否包含正确的5’引物，3’引物及polyA尾，将序列分成全长序列（包含5’引物，3’引物及polyA尾）和非全长序列。去除CCS序列中cDNA 引物序列及polyA序列获得建库时的插入序列，同时根据建库时两端引物的差别确定链合成方向，将序列分为全长序列和非全长序列、嵌合序列和非嵌合序列。全长序列长度反映了建库时cDNA序列长度，可通过统计全长序列的长度评估建库质量。

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转录本GO注释

GO数据库是GO组织（Gene Ontology Consortium）于2000年构建的一个结构化的标准生物学注释系统，旨在建立基因及其产物知识的标准词汇体系，适用于各个物种。GO注释系统是一个有向无环图，包含三个主要分支，即:生物学过程（Biological Process），分子功能（Molecular Function）和细胞组分（Cellular Component）。

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可变剪接分析

基因转录生成的前体mRNA（pre-mRNA），有多种剪接方式，选择不同的外显子，产生不同的成熟mRNA，从而翻译为不同的蛋白质，构成生物性状的多样性。这种转录后的mRNA加工过程称为可变剪接或选择性剪接（Alternative splicing）。可变剪接类型包括：(A) 外显子跳跃；(B) 可变转录终止位点；(C) 可变外显子；(D) 可变转录起始位点；(E) 内含子保留。百迈客使用Astalavista软件获取每个样品存在的可变剪接类型。结合RNA-Seq数据可以使用rMATS进行不同分组间的差异可变剪接分析。

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转录本NR注释

Nr数据库是NCBI中的非冗余蛋白质数据库，包含了Swissprot、PIR(Protein Information Resource)、PRF(Protein Research Foundation)、PDB(Protein Data Bank)蛋白质数据库及从GenBank和RefSeq的CDS数据翻译过来的蛋白质数据信息。通过序列比对寻找同源物种，并进行注释。

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转录本KEGG注释

在生物体内，不同的基因产物相互协调来行使生物学功能，对表达基因的通路（Pathway）注释分析有助于进一步解读基因的功能。KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）是系统分析基因功能、基因组信息数据库，它有助于研究者把基因及表达信息作为一个整体网络进行研究。

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可变多聚腺苷酸化

多聚腺苷酸化是指多聚腺苷酸与信使RNA（mRNA）分子的共价链结。在蛋白质生物合成的过程中，这是产生准备作翻译的成熟mRNA的方式的一部份。在真核生物中，多聚腺苷酸化是一种机制，令mRNA分子于它们的3’端中断。多聚腺苷酸尾（或聚A尾）保护mRNA，免受核酸外切酶攻击，并且对转录终结、将mRNA从细胞核输出及进行翻译都十分重要。在原核生物中，前体mRNA的可变多聚腺苷酸化（alternative polyadenylation,APA）可能贡献于转录组多样性，基因组的编码能力以及基因的调控机制。百迈客采用TAPIS pipeline来对全长非嵌合序列（FLNC）进一步分析以识别APA。

成功案例

PacBio全长转录组数据处理中各个术语的概念

答：1）Polymerase Read：酶聚合序列，DNA聚合酶以SMRTbell?环状模板链合成的核酸序列，可用于测序过程中每轮（run）的质控。Polymerase reads经过滤后仅剩余高质量片段，包含接头序列和通过环状模板链合成的含多个序列的拷贝。
（2）Subread:每个聚合酶序列（polymerase read）可以分割成一个或多个子序列（Subread），subread是聚合酶以SMRTbell? 一条模板链经过一轮（passes）合成的，不包括接头序列。每个subread包含质量值和相关酶活参数。
（3）number of full passes：指原始序列中存在两端均含有SMRTbell? 接头（adapter，图中黑色区域）的子序列（接头间的序列）个数。
（4）Circular Consensus (CCS) Read:根据需求筛选原始序列中满足最小full pass数为 1，最低序列准确度为 0.9 的原始序列，通过子序列获得一致序列即为每个单分子测序反应器ZMW的CCS序列。CCS序列是每个单分子测序反应器ZMW里插入序列的最高质量序列。CCS序列可以从一定程度上评估建库质量和SMRT? Cell上样时序列的长度。
（5）Full-Length (FL) Read versus Non-Full-Length (nFL) Read:定义两端同时含有3’引物和5’引物，及3’引物前含有polyA尾（可选）的序列称为全长序列（Full-Length(FL) Read）。 5’或3′ primer 可以是Clontech或其他全长cDNA建库引物，或基因特异性的RT-PCR引物。反之，则为非全长序列（non-full-lengthread）。
（6）Full-Length non-chimericRead (FLNC)：建库过程中因接头浓度或SMRTbell浓度过低造成两个cDNA模板链直接相连而生成的嵌合序列称为人工嵌合序列，如下图所示。全长序列中的非嵌合序列称为全长非嵌合序列。

PacBio全长转录组是否可以进行定量？

答：PacBio全长转录组由于单cell产出有限，所以无法完成基因定量，需要结合二代转录组（RNA-seq)的数据联合分析，才可以进行基因水平和转录本水平的定量，通常可以选择全长转录组2+3的联合分析产品进行分析。

PacBio全长转录组的优势是什么？

答：

1、无需打断，可直接获得从5’端到3’端的全长转录本序列

2、转录本序列准确性高，连续性、完整性更好

3、准确鉴定转录本水平的结构变异，如可变剪接、融合基因等

4、结合二代转录组测序，同时完成基因水平和转录本水平的准确定量

5、物种适应性高，有无参考基因组均可以进行分析

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