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全长微生物多样性

物种水平精准研究

产品介绍

三代微生物多样性是基于?PacBio 测序平台，利用单分子实时测序（SMRT Cell）的方法对 marker 基因进行测序，之后通过对 CCS（Circular Consensus Sequencing）序列过滤，得到 Optimization-CCS 进行 OTUs（Operational Taxonomic Units）聚类，并进行物种注释及丰度分析，可以揭示样品的物种构成； 进一步进行α多样性分析（Alpha Diversity）、β多样性分析（Beta Diversity）和显著物种差异分析等等，可以挖掘?样品之间的差异。

目前，微生物多样性研究主要是于编码核糖体RNA的核酸序列保守区进行的。细菌主要是基于16S区，真菌主要基于18S区或ITS区（内转录间区），16S rDNA 是编码原核生物核糖体小亚基rRNA（16S rRNA）的DNA序列，18S rDNA是编码真核生物核糖体小亚基rRNA（18S rRNA）的DNA序列，ITS是编码真核生物核糖体小亚基rRNA的DNA内转录间隔区序列。这些序列中既有保守区又有可变区，保守序列区域反映了生物物种间的亲缘关系，而高变序列区域则能体现物种间的差异。由于18S rDNA在进化速率上比较保守，在系统发育研究中较适用于种级以上阶元的分类。常用作微生物分类研究的ITS分为ITS1和ITS2两种。ITS1位于真核生物核糖体rDNA序列的18S和5.8S之间，ITS2位于真核生物核糖体rDNA序列5.8S和28S之间。由于ITS区在核糖体RNA加工过程中被剪切掉，不发挥功能作用，在进化过程中选择压力较小，进化速率约为18S rDNA的10倍，属于中度保守的区域，利用它可研究种及种以下的分类阶元。另外，也可通过选择引物同时扩增18S rDNA和ITS，通过分析18S rDNA序列，先在较高级别上确定样品的归属，然后根据ITS 序列，将真菌归类到种或亚种水平。

物种注释率统计

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“种”水平精准注释全面突破助力科研新高度

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我们对不同类型的样品如：土壤、粪便、肠道、水体等，随机挑选了30个项目对其进行物种注释率进行研发优化，目前采用优化数据库及注释方法的策略，将其种水平平均注释率提升到60%+。二代注释到属和种的平均比例为78%和6%，相同样品采用三代进行注释时，属和种水平平均注释率为95%和60%，注释结果提升非常明显。

不同环境样本中随机抽取物种注释率统计

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Subreads(passes)
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全长系列不能分类到种水平的比例最低

实测项目物种注释率统计

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测序数据量饱和度

基于PacBio SMRT单分子实时测序技术可以对DNA序列实现单分子级别的超长读长测序，能够轻易实现对环境样品中rDNA/ITS/功能基因进行全长测序，不受制于短序列的局限性，提供了种甚至菌株水平的物种分辨率，更全面的解释物种的多样性。

统计数据结果显示：单样本5000条CCS即可达到饱和。

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统计数据结果显示：单样本5000条CCS即可达到饱和。

产品类型

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工作流程

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建库测序：

提取样品总 DNA 后，根据 16S 全长引物 27F 和 1492R（及其他全长引物），合成带有 Barcode 的特异引物，进行 PCR 扩增并对其产物进行纯化、定量和均一化形成测序文库（SMRT Bell），建好的文库先进行文库质检，质检合格的文库用 PacBio Sequel 进行测序。PacBio Sequel下机数据为 bam 格式,通过 smrtlink 分析软件导出 CCS 文件, 根据 Barcode 序列识别不同样品的数据并转化为 fastq 格式数据。

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测序原理图

生信流程：

数据预处理：将 PacBio 下机数据导出为 CCS 文件( CCS 序列使用 Pacbio 提供的 smrtlink 工具获取)后，主要有如下3个步骤：

1)CCS识别：使用?lima v1.7.0软件，通过barcode对CCS进行识别，得到的Barcode-CCS序列数据；

2)CCS长度过滤：使用百迈客公司自主研发的软件，对Barcode-CCS进行过滤，得到有效序列；

3)去除嵌合体：使用?UCHIME v4.2软件，鉴定并去除嵌合体序列，得到 Optimization-CCS 序 列。

信息分析内容：划分OTU、多样性及差异性分析（具体见分析结果）。

结果展示

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送样要求

环境样品 送样要求 保存及运输
普通土壤 除去土壤表层未分解的凋落物层、动植物残体、石砾等杂质，将大块的样品捣碎，过2mm筛后，分装至2mL或更大体积的EP管或冻存管中；每管土壤含量大概0.25~0.5g，需保证送样量在1~2g。  

 

 

样本-80℃或液氮中长期保存，干冰运输
根际土壤 收集植物植株，去除根部大块土壤；摇动植株去除附着不紧密的土壤，使用无菌刷子收集根部附着紧密的土壤；随机多点取样5-10g，过2mm筛后，分装至2mL或更大体积的EP管或冻存管中；每管土壤含量大概0.25~0.5g，需保证送样量在1~2g。
粪便 无菌牙签或粪便取样器截取样品中段内部（避免表层中的肠道膜脱落细胞），外部容易污染且细菌DNA由于接触空气可能有降解。将已取的粪便样品分装至2mL?EP管（无菌）或冻存管（无菌）中，每管粪便量为0.5~2g，每个样品分装2~3管备份。
肠道内容物 在实验对象死亡后，无菌条件下，取出整个肠道，用无菌解剖刀切取所需肠段的，用无菌手术刀挖取内容物分装至2mL?EP管（无菌）或冻存管（无菌）中，每管组织量为0.5~2g，每个样品分装2~3管备份
水体 过滤大量低微生物含量的清亮水样用0.22μm?的聚苯醚砜滤膜，每个样本至少1L水样。浑浊水样使用0.22μm滤膜过滤缓慢容易堵塞时，建议使用0.45μm的混合纤维素酯滤膜，每个样本0.5L-1L水样；如果水样中不可溶解的颗粒较多，需要使用2-5μm孔径的滤膜将不可溶解的颗粒杂质滤去，再使用0.22μm或0.45μm的滤膜富集菌体，每个样本0.5L-1L水样。
空气 开动采样仪（浮游细菌采集器），使被测空气滤过凝胶膜（灭菌），空气中的浮游菌被截留在凝胶膜上（过滤时间越长，收集的空气中的灰尘越多，菌数量越多），收集完成后取下滤膜。

DNA样本：

项目类型

浓度

总量

纯度

完整性

微生物多样性

≥10ng/μL（Qubit）

≥500ng

扩增条带正常

主带清晰，无降解或轻度降解

引物列表：

内容 项目 引物名称 序列 扩增产物长度
全长 16S 全长 27F 5′-AGRGTTTGATYNTGGCTCAG-3′ 1.5K
1492R 5′-TASGGHTACCTTGTTASGACTT-3′ 1.5K
18S全长 EukA 5′-AACCTGGTTGATCCTGCCAGT-3′ 1.8K
EukB 5′-GATCCTTCTGCAGGTTCACCTAC-3′ 1.8K
ITS 全长 ITS1 5′- CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′ 0.6-0.7K
ITS4 5′- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′ 0.6-0.7K

案例展示

案例一：

Bacterial compatibility and immobilization with biochar improved tebuconazole degradation, soil microbiome composition and functioning

发表时间：2020

合作单位：青岛农业大学

发表期刊： Journal of Hazardous Materials

研究背景：戊唑醇杀菌剂是一种应用广泛的杀菌剂，对水生生物和人类健康具有潜在威胁。微生物降解农药是一种高效、低成本和环境友好的方法。本研究假设生物炭可能是降解戊唑醇细菌的理想载体，而固定化生物炭比自由施用的细菌可能加速戊唑醇从土壤中的去除。为了验证这一点，我们以麦秸源生物炭为载体，利用戊唑醇降解菌WZ-2对污染土壤进行生物修复。

测序策略： Pacbio SequelII 全长16S测序

研究结论：菌株WZ-2和固定化生物炭的WZ-2加速了戊唑的降解，使戊唑在土壤中的半衰期分别从40.8天降低到18.7天和13.3天。虽然戊唑醇对土壤酶活性(脲酶、脱氢酶、转化酶)和微生物群落结构有负面影响，但固定化生物炭的WZ-2不仅加速了戊唑醇的降解，而且恢复了土壤微生物酶活性和微生物群落组成。

参考文献： Sun T, Miao J, Saleem M, Zhang H, Yang Y, Zhang Q. Bacterial compatibility and immobilization with biochar improved tebuconazole degradation, soil microbiome composition and functioning.?J Hazard Mater. 2020

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生物炭固定化细菌对土壤微生物群落组成的影响
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戊唑醇不同处理降解动力学拟合曲线

案例二：

Arsenic exposure induces intestinal barrier damage and consequent activation of gut-liver axis leading to inflammation and pyroptosis of liver in ducks

发表时间：2021

合作单位：华南农业大学

发表期刊： Science of the Total Environment

研究背景：砷是一种重要的有害金属，普遍存在于受污染的土壤、河流和地下水中。然而，关于三氧化二砷(ATO，砒霜)对水禽肠-肝轴的影响及其肝毒性的研究还很少。本研究探讨了肠-肝轴在三氧化二砷诱导的肝毒性和肠道毒性中的作用。

测序策略：Pacbio SequelII 全长16S

测序 研究结论： ATO暴露可引起鸭肠道菌群α-多样性显著降低， 对照组中凸腹真杆菌、产硫球链菌、类肠膜魏斯氏菌和厌氧消化链球菌等更丰富。ATO暴露显著降低肠道屏障相关蛋白的表达，导致肠道通透性增加和脂多糖水平升高；上调了肝脏和空肠的焦亡相关指数，并增加了促炎细胞因子的产生。进一步的机制研究表明，ATO诱导的肝脏和空肠炎症是由LPS/TLR4/NF-κB信号通路和NLRP3炎症小体的激活引起的。这些结果表明，ATO暴露可导致肝脏和空肠炎症和焦亡，而间接的肠-肝轴通路可能在ATO诱导肝毒性的潜在机制中发挥重要作用。

参考文献： Zhong G, Wan F, Lan J, et al. Arsenic exposure induces intestinal barrier damage and consequent activation of gut-liver axis leading to inflammation and pyroptosis of liver in ducks.?Sci Total Environ. 2021

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ATO暴露改变了鸭肠道微生物的多样性

更多案例

样本类型 年份 期刊 IF 合作单位 题目
土壤 2020 Journal of Hazardous Materials 10.588 青岛农业大学 Bacterial compatibility and immobilization with biochar improved tebuconazole degradation, soil microbiome composition and functioning
牛瘤胃 2020 Frontiers in microbiology 5.64 湖南农业大学 Fermented Soybean Meal Replacement in the Diet of Lactating Holstein Dairy Cows: Modulated Rumen Fermentation and Ruminal Microflora
鸡肠道 2021 Science of the Total Environment 6.551 华南农业大学 Arsenic exposure induces intestinal barrier damage and consequent activation of gut-liver axis leading to inflammation and pyroptosis of liver in ducks
土壤 2021 Frontiers in Microbiology 5.64 沈阳农业大学 Influence of Peanut, Sorghum, and Soil Salinity on Microbial Community Composition in Interspecific Interaction Zone
青贮发酵 2021 Frontiers in Microbiology 5.64 湖南农业大学 Fermented Soybean Meal Replacement in the Diet of Lactating Holstein Dairy Cows: Modulated Rumen Fermentation and Ruminal Microflora
青贮发酵 2021 Food and Energy Security 5.21 中国农业大学 Microorganisms that are critical for the fermentation quality of paper mulberry silage
小鼠盲肠内容物 2021 Ecotoxicology and Environmental Safety 6.291 首都医科大学 Characterization of gut microbiota, metabolism and cytokines in benzene-induced hematopoietic damage
小鼠肠道 2021 Food & Function 5.396 福建师范大学 Kombucha ameliorates LPS-induced sepsis in a mouse model
肠道 2021 Journal of Hazardous Materials 10.588 成都生物研究所 Animal gut microbiome mediates the effects of antibiotic pollution on an artificial freshwater system

我们的优势

  • 1.PB全长多样性测序基于HiFi模式对单一片段进行多轮测序的方式来提升准确性。由于Pacbio的原始错误为随机错误，可通过获取CCS进行自身纠正来提升数据的准确性。同一片段测序 5 次后，单一Read的准确性至少达到Q20（99%）。
  • 2.全长序列中携带的特征信息更多，可以支持“种”水平的分辨率；
  • 3.群落结构更准确，避免了短读长扩增子的PCR引物选择会影响推断的群落准确性和某些细菌类群的敏感性；
  • 4. CCS扩增子测序模式结合DADA2软件算法，可获得单碱基/近零错误率的全长rRNA基因序列。

常见问题

全长微生物多样性有什么优势？

全长微生物多样性最主要优势为种水平注释率高，三代测序技术可以实现多多个高变区进行测序，能够更为准确的还原群落结构。

送样过后整体流程是什么样的？

收到您的样本后跟进项目类型进行提取扩增，建库测序到数据分析，交付原始数据和结题报告，售后服务。

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