全长转录组是指借助三代测序平台对完整转录本进行不打断的全长测序，序列准确性远远高于需要进行打断测序的二代常规转录组，因此适用于进行转录本结构性的分析，例如可变剪切分析，可变剪切是指同一个基因的前体mRNA可以通过不同的剪接方式产生多种成熟的mRNA，进而翻译成不同的蛋白质，是真核生物中及其重要的调控方式。

本次为各位老师带来重庆医科大学黄爱龙教授/唐开福教授团队在nature子刊?Nature Communications?中发表的题目为“SARS-CoV-2 N protein-induced Dicer, XPO5, SRSF3, and hnRNPA3 downregulation causes pneumonia”的文章。该文章研究了 SARS-CoV-2 N 蛋白如何影响 RNA 干扰 (RNAi) 和 RNA 剪接途径，并揭示了这些途径在 COVID-19 发病机制中的作用，有助于开发更有效的 SARS-CoV-2 相关肺炎治疗方法。

中文题目：SARS-CoV-2 N蛋白诱导的Dicer、XPO5、SRSF3和hnRNPA3下调导致肺炎

英文题目：SARS-CoV-2 N protein-induced Dicer, XPO5, SRSF3, and hnRNPA3 downregulation causes pneumonia

发表期刊：Nature Communications?

影响因子：14.7

合作单位：重庆医科大学

百迈客生物为该研究提供了小RNA测序和ONT全长转录组测序服务。

研究背景

2019 冠状病毒病 （COVID-19） 由严重急性呼吸系统综合症冠状病毒 2 （SARS-CoV-2） 引起，具有高度异质性，且发病病例分布在各个年龄群体中，但重症及死亡率明显字老年群体比较集中。DNA 损伤是导致衰老的关键因素，也是 COVID-19 发病机制的驱动因素，蛋白质稳态丧失是衰老的另一个标志，会导致不受抑制的炎性小体激活、功能失调的细胞器积累和细胞损伤，可能导致 COVID-19 的发病机制。Dicer 是 RNA 干扰 （RNAi） 通路的关键组成部分，在衰老过程中下调， RNAi 组分的敲除会导致 DNA 损伤，并且可能由于 miRNA的整体下调而增加蛋白质合成，从而影响蛋白质稳态，与年龄相关的剪接因子失调发生在不同生物体的多个组织中，并且与基因组稳定性和蛋白质稳态有关，可通过R环诱导 DNA 损伤。然而，RNAi 成分及RNA 剪接因子在 COVID-19 发病机制中的确切作用还有待明确。

材料和方法

材料：异位表达 N 蛋白的人肺癌 （A549） 和人正常肺上皮 （BEAS-2B） 细胞系 ，N 蛋白诱导的雄性肺损伤小鼠及正常对照 C57BL/6J 雄性小鼠；

方法：小RNA测序+ONT全长转录组+免疫组化+RIP等

研究结果

1.SARS-CoV-2核衣壳 （N） 蛋白诱导自噬降解及DNA损伤的作用机制

通过对已发表的COVID-19 患者RNA测序数据的分析，确定了重症 COVID-19 患者 M-MDSC 中 RNAi 成分和剪接因子的 mRNA 水平低于无症状 COVID-19 患者，且已故 COVID-19 患者肺组织中的 RNAi 成分和剪接因子水平也低于未感染 COVID-19 的个体，表明RNAi 成分和剪接因子的表达减少与 COVID-19 感染加重有关。

细胞沉默逆转测定使用含有内含子的荧光素酶报告基因小基因证明了 SARS-CoV-2 抑制了该小基因的剪接。该研究从相互作用数据集的生物通用存储库 （BioGRID） 中检索了 N 蛋白的推定蛋白质相互作用子，并用免疫共沉淀测定证实了异位表达 N 蛋白的人肺癌 （A549） 和人正常肺上皮 （BEAS-2B） 细胞系中 N 蛋白与?Dicer、XPO5、SRSF3和hnRNPA3?之间的相互作用，进一步定量测定结果发现，SARS-CoV-2 感染导致?Dicer、XPO5、SRSF3和hnRNPA3在蛋白水平上下调，但在 mRNA 水平上不下调，而自噬抑制剂氯喹或巴弗洛霉素 A1 治疗可缓解 N 蛋白或 SARS-CoV-2 诱导的?Dicer、XPO5、SRSF3?和?hnRNPA3?下调，用蛋白酶体抑制剂 MG132 处理并无效果，表明?N 蛋白对?Dicer、XPO5、SRSF3?和?hnRNPA3?蛋白表达的影响是自噬依赖性的。

在 BioGRID 数据库中找到了一种自噬受体蛋白SQSTM1/p62 ，共聚焦显微镜分析和免疫共沉淀分析分别证实了 N 蛋白和 p62 之间的相互作用及其共定位，p62 敲低部分缓解了 N 蛋白诱导的?Dicer、XPO5、SRSF3?和?hnRNPA3?蛋白的下调；然而，它不会影响不表达 N 蛋白的细胞中的?Dicer、XPO5、SRSF3?或?hnRNPA3?蛋白水平，表明?p62 通过与 N 蛋白的相互作用将 N 蛋白相互作用蛋白（包括?Dicer、XPO5、SRSF3?和?hnRNPA3）募集到吞噬细胞中，导致自噬降解。

ATM等的磷酸化、DNA 断裂积累等病灶形成证明了异位 N 蛋白表达或 SARS-CoV-2 感染诱导了 DNA 损伤，敲低?Dicer、XPO5、SRSF3?或?hnRNPA3?导致 DNA 损伤，而它们的过表达部分减轻了 N 蛋白诱导的 DNA 损伤，同时异位 N 蛋白表达或 SARS-CoV-2 感染诱导了 R 环积累，进一步诱导DNA损伤，RNase H1（一种降解 R 环的 RNA 部分的核糖核酸内切酶）的过表达部分减轻了这种影响并减少了 DNA 损伤积累，总的来说，这些发现表明?N 蛋白诱导的 Dicer 、 XPO5 、 SRSF3 和 hnRNPA3 表达下调导致 DNA 损伤。

2.SARS-CoV-2 N蛋白通过抑制 miRNA 生物发生及抑制 RNA 剪接作用机制

XPO5和Dicer在 miRNA 生物合成中起关键作用，小 RNA 深度测序显示，N 蛋白诱导 miRNA 表达的整体下调，对 A549 和 BEAS-2B 细胞中表达量最高的前五个 miRNA进行定量验证显示，它们在表达 N 蛋白的细胞和 SARS-CoV-2 感染的细胞中均下调；生化分级分离实验显示，异位 N 蛋白表达或 SARS-CoV-2 感染诱导 pre-miRNA 的核保留，如细胞核中 pre-miRNA 水平的增加和细胞质中 pre-miRNA 水平的降低所示，?XPO5过表达后得到缓解。此外，异位 N 蛋白表达或 SARS-CoV-2 感染降低了成熟 miRNA 和 pre-miRNA 之间的比率，Dicer过表达后得到缓解。总体而言，这些发现表明，N 蛋白通过降低?XPO5?表达阻断 pre-miRNA 从细胞核到细胞质的运输，并通过下调?Dicer?表达抑制 pre-miRNA 向成熟 miRNA 的加工。

SRSF3或hnRNPA3敲除抑制了含有内含子的报告基因小基因的剪接，证实了它们确实是剪接因子，而它们的过表达部分缓解了 N 蛋白或 SARS-CoV-2 感染对 RNA 剪接的抑制作用，进一步进行全长转录组测序，通过可变剪接分析发现，N 蛋白诱导内含子保留。此外，RT-qPCR证实，异位 N 蛋白表达或 SARS-CoV-2 感染降低了一组内源性内含子的剪接效率，SRSF3?和?hnRNPA3?过表达部分减轻了 N 蛋白和 SARS-CoV-2 对 RNA 剪接的抑制作用，这些结果表明，N 蛋白通过降低?SRSF3?和?hnRNPA3?的表达来抑制 RNA 剪接。

剪接抑制会诱导广泛的 IR 和随后的内含子保留 mRNA 的翻译，一部分内含子衍生的多肽容易缩合且具有蛋白毒性，用嘌呤霉素对新生多肽进行代谢标记，结果显示异位 N 蛋白表达或 SARS-CoV-2 感染诱导不溶性蛋白合成增加，而N蛋白与RNA的结合主要在可溶性蛋白部分被检测到，免疫荧光检测结果表明，N 蛋白和 SARS-CoV-2 感染诱导了 EGFP 聚集体的产生，诱导蛋白毒性应激。

3.SARS-CoV-2 N 蛋白在蛋白水平的影响及动物模型验证

尽管异位 N 蛋白表达或 SARS-CoV-2 感染导致 4EBP1 去磷酸化，但它增加了整体蛋白质合成，而没有显着影响 S6K1 磷酸化，对照组的刺突蛋白和膜蛋白对整体蛋白质合成没有影响，而包膜蛋白甚至抑制了整体蛋白质合成，Dicer?或?XPO5?敲低导致 JNK 激活和 4EBP1 去磷酸化，同时略微增加 S6K1 磷酸化并促进蛋白质合成，表明 N 蛋白通过降低?Dicer?和?XPO5?表达来促进蛋白质合成，并通过下调?SRSF3?和?hnRNPA3?表达来抑制蛋白质合成。由于?Dicer?和?XPO5?的下调比?SRSF3?和?hnRNPA3?的下调更显着地促进蛋白质合成，因此 N 蛋白最终增强了蛋白质合成。

小鼠体内验证结果显示， N 蛋白在小鼠肺组织中的表达导致?Dicer、XPO5、SRSF3?和?hnRNPA3?下调、DNA 损伤、胞质 DNA 积累、细胞凋亡、IFNβ、IL-6 和 NKG2D 配体上调，以及伴有明显巨噬细胞浸润的肺炎，肺组织中?Dicer、XPO5、SRSF3?和?hnRNPA3?敲低导致肺损伤和肺炎，而它们的过表达部分缓解了 N 蛋白诱导的肺炎，这些结果表明，N 蛋白诱导的?Dicer、XPO5、SRSF3?和?hnRNPA3?蛋白表达下调是 SARS-CoV-2 诱导肺炎的一种机制。

分析已发表的 3、6、12 和 24 个月龄 C57BL/6J 小鼠肺组织的 RNA 测序数据，在 8 周龄和 18 个月龄 C57BL/6J 小鼠的 mRNA 和蛋白质水平上证实了肺组织中?Dicer、XPO5、SRSF3?和?hnRNPA3?的年龄依赖性下调， DNA 损伤、细胞凋亡等功能在老年小鼠中明显富集，结合Dicer、XPO5、SRSF3?和?hnRNPA3?敲低实验，表明，Dicer、XPO5、SRSF3?和?hnRNPA3?的年龄相关下调与 N 蛋白诱导的肺炎严重程度增加有关。

PJ34 是一种（ADP-核糖）聚合酶 （PARP） 抑制剂，免疫沉淀结果表明 PJ34 通过阻止 N 蛋白诱导的?Dicer、XPO5、SRSF3?和?hnRNPA3?的下调来缓解肺炎，阿那曲唑是一种增强 Dicer 表达的芳香化酶抑制剂，WB结果表明，阿那曲唑通过促进?Dicer、XPO5、SRSF3?和?hnRNPA3?的表达来缓解 SARS-CoV-2 N 蛋白诱导的肺炎。

思路发散

本研究通过数据库检索及分子实验验证先初步推测SARS-CoV-2 N蛋白的年龄依赖调控机制与RNAi以及可变剪接相关，之后通过组学测序在整体水平上验证了猜测并进一步细化了调控方式，之后再通过大量过表达及敲降后对应分子在RNA及蛋白水平的定量验证了结果，是一个比较经典有效的实验思路，可以在其他实验中参考。

参考文献：

Luo YW, Zhou JP, Ji H, Xu D, Zheng A, Wang X, Dai Z, Luo Z, Cao F, Wang XY,Bai Y, Chen D, Chen Y, Wang Q, Yang Y, Zhang X, Chiu S, Peng X, Huang AL, Tang KF. SARS-CoV-2 N protein-induced Dicer, XPO5, SRSF3, and hnRNPA3 downregulation causes pneumonia.?Nat Commun. 2024 Aug 13;15(1):6964. doi:10.1038/s41467-024-51192-1.