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发布于 2023年2月8日

分类：医学研究, 基因组测序, 微生物组测序, 时空组学, 群体遗传, 质谱检测, 转录组测序

?人生最悲哀的事儿是什么呢？我想对于走在科研道路上的您，莫过于千辛万苦准备的样品，兴高采烈的送去做测序。等来的却是远方传来的噩耗，我方核酸因取样时处理不当，现已“阵亡”。小编虽是各位老师科研道路上的甲乙丙丁，但却感同身受。所以整理了这篇软文和大家共同分享一下样品制备方面的知识，以期能够对大家的科研有所帮助

植物组织的采集及处理

被子植物6大器官模式图

1、在与研究目的不冲突的前提下，尽量选取新鲜、幼嫩、生长状态良好的组织部位。植物组织越幼嫩新鲜所含的次生代谢产物就越少，随着植物组织的逐渐成熟，次生代谢产物的含量会逐渐增多，而次生代谢产物的存在会影响核酸的提取效果，次生代谢产物越多，核酸提取越困难，得率也越低。

2、如果植物组织表面污渍较多，在采集之前应迅速用预冷的纯净水或75%乙醇擦拭或冲洗干净，再用吸水纸吸干组织表面残留液体。

3、将处理好的组织样本混合均匀后保存于2 mL或更大体积的旋盖冻存管中。

4、建议10min中内（越快越好）置于液氮中冷冻1h以上，然后转移至-80℃长期保存，干冰运输。

动物组织的采集及处理

1、液氮速冻法详细流程:

1）提前准备好冷冻组织的足量液氮，预装样品的冻存管，并在做好标记（尽量不使用汉字命名，命名字符控制在5个以内）

2）活体取下新鲜组织，立即剔除结缔组织等非研究所需的组织类型。对肿瘤组织的取材，应尽可能准确地判定肿瘤和正常组织，肿瘤组织应将周围的正常组织切除干净（正常组织也应周围的肿瘤组织切除干净），肠道组织一定要把内容物清洗干净；

3）迅速用预冷的PBS溶液（RNase free）或0.9%生理盐水将组织表面的残留血液冲洗干净

4）如果组织体积较大，将组织切成长宽高均≤0.5 mm 的小块（即黄豆大小）

5）将冻处理好的组织样本混合均匀后保存于2 mL 或更大体积的螺口冻存管（RNase free）中，标注编号。

6）立即（20s内）置于液氮中冷冻 3~4 h，然后转移至-80 °C长期保存

7）干冰运输。

2、TRIzol法(仅限于RNA类产品):

1）如果使用 TRIzol裂解液保存送样，请务必先进行液氮研磨破碎，然后溶于 TRIzol 中组织样品切勿过量；

2）震荡混匀，常温裂解 5 min 后，使用低温离心机12000g离心10min，将上清液转至新的2.0ml离心管中（拍质控照片，方便核查），转移至-80℃低温保存，运输时选择干冰寄送。

3、RNAlater??Tissue Collection保护液法(仅限于RNA类产品):

1）用RNAlater??Solution保存组织之前，需要将组织切割成长宽高均≤ 0.5 mm的小块。

2）如果组织带血液或其他体液，需要过夜后更换一次RNAlater??Solution；不要将刚浸入RNAlater Solution中的样本立即冷冻，需将样本置于4 °C 保存过夜（使Solution充分浸润组织样本），然后转移至-20 °C 或-80 °C 长期保存；

3）RNAlater??Solution 不会影响组织结构，可以把已保存的组织从 RNAlater??Solution中取出，切下实验所需的用量，把剩余的组织再放入到原来的保存液中继续保存；

4）保存于RNAlater??Solution中样本，-20 °C 存放时，样本不会结冻，但可能会有晶体析出，这并不影响后续的 RNA 提取工作；-80 °C 存放时，样本会结冻，在进行 RNA 提取前，需置于冰上融化再进行后续操作，解冻后的样本可再次放入-80 °C 保存；

5）一般来讲，生物样本保存于RNAlater??Solution中，37 °C可存放1天，25 °C（室温）可存放1周，4 °C 可存放1个月，-20 °C 或-80 °C 可长期保存。但鉴于生物样本的特殊性及实验可重复性，建议所有保存于RNAlater??Solution中样本，都要置于-20 °C 或-80 °C 长期保存。

微生物样品的采集及处理

细菌

注意：所有菌类样品必须分离好菌体或菌丝送样，切勿连带培养基一起寄送，带培养基的菌体无法提取。

1）显微镜下观察细菌生长状态，尽量收集生长期处于对数期的细菌。

2）将适量体积的菌液转移至2 mL 旋盖尖底离心管（无菌，无核酸酶）中，于室温下14000 ×g 离心1 min。

3）弃掉培养基，将细菌菌体沉淀迅速置于液氮中冷冻1-3 h以上（冻存时间视组织量而定，保证样品冻存充分），然后转移至-80 °C长期保存。

4）将样品管置于管架上固定好后埋在干冰箱的中间部位，大体积干冰运输。

真菌

真菌的形态多样，一般分为单细胞和多细胞真菌，酵母菌属于单细胞真菌，而霉菌和蕈菌（大型真菌）都属于多细胞的真菌。

单细胞真菌

单细胞真菌以酵母菌为代表。一次提取反应所需酵母菌的量需≤1×10⁷个，以 5×10⁶-1× 10⁷个为宜。您要做的项目要求送样量较大时，可以将样品按上述数量要求分装后单独保存。

1）显微镜下观察酵母菌生长状态，尽量收集生长期处于对数期的酵母菌。

2）将适量体积的酵母菌液转移至将2 mL旋盖尖底离心管中（无菌，无核酸酶），于室温下14000×g 离心1 min。

3）弃尽培养基，将酵母细胞沉淀迅速置于液氮中冷冻1-3 h以上（冻存时间视组织量而定，保证样品冻存充分），然后转移至-80 °C长期保存。

4）将样品管置于管架上固定好后埋在干冰箱的中间部位，大体积干冰运输

细胞样品的采集及处理

贴壁细胞

一次提取反应所需细胞数≤1 X 10^7 ?个，以3 X 10^6-1 X 10^7 ?个为宜，可以将细胞经裂解液裂解后冻存运输。

1、从培养箱中取出贴壁培养的细胞，显微镜下观察细胞，确定生长状态良好（正常细胞融合度在80 %左右）;

2、弃去培养基，向细胞培养瓶或培养皿中加入 5mL PBS（RNase free），清洗一次后弃尽PBS；

3、加入1mlPBS（RNase free）重悬后将细胞转移至 1.5 mL 旋盖尖底离心管（RNase free）中；

4、离心（依据客户实验室细胞离心步骤，注意细胞离心要适度，不要使细胞离心过实而造成裂解液不能充分渗透，4度离心机，转速3000g为宜）得到细胞沉淀，弃去PBS，置于液氮中速冻2h后转移至-80℃低温保存，送样时选择干冰运输寄送。

运输方式：干冰运输。

*TRIzol 裂解法（仅限于RNA类产品）：

离心收集的细胞迅速溶于 TRIzol 裂解，参考用量为每 5 X 10^6个细胞加 1 mL TRIzol；细胞溶于 TRIzol 后，如出现成团，需用吸头将细胞团吹打散，或者激烈震荡混匀，使细胞完全溶于 TRIzol 中充分裂解，室温静置5min，之后转移至-80℃低温保存，送样时选择干冰运输寄送。

*注：判断裂解液加入量是否合适的标准可以根据细胞溶解物的黏度来判断。在细胞刚溶解时，可以发现有丝状物出现，若裂解液加入量合适，吹打几次后，丝状物会消失，液体黏稠性下降；若裂解液的量过少，丝状物往往一直存在，液体黏稠性大，应继续补加裂解液。裂解液加入量过少，会导致抽提的 RNA 降解。

液氮速冻法：

离心收集的细胞直接液氮速冻，速冻2h后转移至-80℃低温保存，送样时选择干冰运输寄送。

悬浮细胞

一次提取反应所需细胞数≤1 X 10^7 ?个，以3 X 10^6-1 X 10^7 ?个为宜，可以将细胞经裂解液裂解后冻存运输。

1、确定细胞生长状态良好；离心得到细胞沉淀（依据客户实验室细胞离心步骤，注意细胞离心要适度，不要使细胞离心过实而造成裂解液不能充分渗透，4度离心机，转速3000g为宜）；

2、弃去培养基，加入 1 mlLPBS（RNase free，室温），轻轻将细胞沉淀悬起，转移至 1.5 mL 旋盖尖底离心管（RNase free）中；

3、离心（依据客户实验室细胞离心步骤，注意细胞离心要适度，不要使细胞离心过实而造成裂解液不能充分渗透，4度离心机，转速3000g为宜）得到细胞沉淀，弃去PBS，置于液氮中速冻2h后转移至-80℃低温保存，送样时选择干冰运输寄送。

运输方式：干冰运输。

TRIzol 裂解法（仅限于RNA类产品）：

液氮速冻法：

收集的细胞直接液氮速冻后，转移至-80℃低温保存，送样时选择干冰运输寄送。

全血样品的采集及处理

RNA类全血样品制备

1、采血管选择

采集血液进行检测面临的一个主要问题就是细胞内 RNA 的不稳定性，RNA 在采血后数小时内便会迅速降解。此外，某些种属的 RNA 在采血后会通过基因诱导在体外增加。体外RNA 降解和基因诱导均可导致体内相关基因的转录本数目低估或高估。

BD 公司的 PAXgene 血液 RNA 管内含能够稳定体内基因转录性状的添加剂，它能够减少体外 RNA 的降解，并将基因诱导的水平降低到最小程度，适用于人和灵长类动物全血样品制备，对于全血样品，我们只推荐使用此管送样。

BD PAXgene 血液 RNA 管（货号 762165）

2、采集血液

使用PAXgene血液RNA管前请仔细阅读产品说明书，以便进行正确的操作。如果PAXgene血液 RNA 管为唯一的抽血管，则将血液抽入 PAXgene 血液 RNA 管之前应先抽血入“废弃管”内，使抽血过程中所用的采血器内能被血液预灌注；否则 PAXgene 血液 RNA 管应为抽血程序中的最后一只试管。确保血液已停止流入试管再从持针器上取下试管（PAXgene 血液 RNA管内的负压设计可向管内抽 2.5ml 的血）。

采血后应立即将 PAXgene 血液 RNA 管轻轻地颠倒 8-10 次，以确保管内保护剂和血液充分混合均匀。