甲状腺激素受体-β (THR-β) 激动剂 MGL-3196 作为代谢功能障碍相关脂肪性肝炎 (MASH) 药物，然而其个体临床疗效差异较大，并与宿主肝肠循环中的微生物组存在相互作用，目前其对宿主肝肠循环中肠道菌群的干扰尚不明确。

2024年8月21日，北京大学崔一民、安徽医科大学王华教授共同通讯在Journal of Hepatology期刊在线发表题为“Thyroid hormone receptor-beta agonist HSK31679 alleviates MASLD by modulating gut microbial sphingolipids”的研究论文。研究团队运用宏基因组、单细胞转录组和代谢组组学研究了甲状腺激素受体-β激动剂HSK31679在改善代谢相关脂肪性肝炎（MASH）方面的作用，并探究了肠道菌群在其中扮演的角色。研究发现，HSK31679能够有效改善SPF小鼠的MASH，但无菌小鼠则没有这种效果，说明肠道菌群在HSK31679的治疗中起到了关键作用。研究还发现，HSK31679能够增加肠道拟杆菌thetaiotaomicron的相对丰度，并抑制其萄糖神经酰胺合成酶（GCS）活性，从而减少肠道微生物鞘脂的单糖基化，进而改善肝脏脂肪积累。此外，HSK31679还能够重塑髓系细胞动态，使其向抗炎微环境转变，从而进一步减轻MASH。

文章标题：Thyroid hormone receptor-beta agonist HSK31679 alleviates MASLD by modulating gut microbial sphingolipids

发表期刊：Journal of Hepatology

影响因子：26.8

合作单位：北京大学

研究对象：小鼠模型、临床队列

研究方法：微生物多样性测序，宏基因组测序，代谢组检测

百迈客生物为该研究提供了微生物多样性测序，宏基因组测序，代谢组检测服务。

研究背景

甲状腺激素受体-β (THR-β) 激动剂，如 MGL-3196 和 HSK31679，因其对 THR-β 的选择性高而被认为是治疗 MASH 的新兴药物。MGL-3196在临床试验中表现出良好的疗效，但其个体临床疗效差异较大，且存在肠道通透性差的问题。HSK31679 是 MGL-3196 的衍生物，其疗效和安全性正在进一步研究中。肠道微生物组与宿主的代谢健康密切相关，其组成和功能的改变与 MASH 的发生发展密切相关。肠道微生物可以产生多种酶，参与宿主血浆脂质代谢，并可能影响 THR-β 激动剂的活性。该研究旨在探索肠道微生物在 THR-β 激动剂治疗 MASH 中的作用，评估 HSK31679 的疗效和机制以及为 MASH 的治疗提供新的思路和靶点。

材料方法

1.动物实验

对无菌小鼠和 SPF 小鼠进行高脂饮食诱导的 MASH 模型构建，分别给予 MGL-3196 和 HSK31679 治疗，观察肝脂肪变性程度和肝脏指标变化。

对 SPF 小鼠进行?B. thetaiotaomicron 菌株定殖，观察 HSK31679 对 MASH 模型的影响。

2.微生物组分析：

对参与者的粪便进行宏基因组测序，分析肠道菌群组成变化。

对参与者的粪便和血清进行脂质组学分析，检测肠道微生物产生的鞘脂类物质变化。

3.单细胞 RNA 测序：

对18例PBMC样本进行单细胞转录组测序，分析 HSK31679 对免疫细胞的影响。

研究结果

1.HSK31679 在 SPF 小鼠中优于 MGL-3196 治疗高脂饮食诱导的 MASH

为了研究THR-β激动剂治疗 MASH对肠道微生物群的影响，研究者在没有肠道微生物定群的情况下饲养的C57 BL/6 GF小鼠喂食高脂肪、果糖和胆固醇饮食（MASH饮食）和SPF对照组16周。然后每日给予MGL-3196或HSK 31679 3毫克/kg剂量，口服，持续8周（图1A）。如图1B所示，MGL-3196灌胃对SPF和GF小鼠的体重均没有明显影响，而HSK 31679导致SPF小鼠的体重增加具有统计学意义，但GF小鼠没有。服用MASH饮食然后接受MGL- 243 3196/HSK 31679处理的SPF小鼠表现出肝脏重量明显下降（p < 0.01;图1C），HSK31679 组 SPF 小鼠的体重增加、肝脏重量、血清和肝脏甘油三酯和胆固醇水平、血清 ALT、AST 和 GGT 水平以及肝脏脂质变性程度均显著低于 MGL-3196 组。HSK31679 组 SPF 小鼠的肝脏炎症和纤维化相关基因表达水平也显著低于 MGL-3196 组。无菌小鼠模型中，MGL-3196 和 HSK31679 组的 MASH 病理表现相似，表明 HSK31679 的疗效依赖于肠道菌群。

2.HSK31679 治疗增加了肠道 B. thetaiotaomicron?的相对丰度

在MASH饮食喂养16周和HSK31679治疗8周后，观察到SPF小鼠富含肠道拟杆菌thetaiotaomicron（B. thetaiotaomicron）（图1I、J和S2D）。NMDS和PCA分析表明HSK31679重塑了β多样性谱，而每组肠道微生物群的Shannon和Simpson多样性指数略有差异（图S2G和H）。在微生物功能方面，通过KEGG分析富集的7,458条功能途径。其中22条途径在HSK31679治疗后有所不同，包括参与激活神经鞘脂（SL）代谢的途径，在HSK31679实验组中，B. thetaiotaomicron与上调的己糖神经酰胺加工基因密切相关（图1L）。

为了临床验证微生物组组成的这种转变，研究者收集了40名健康参与者的粪便样本，这些参与者接受了每周3次的HSK31679多次递增剂量治疗，持续14天。对参与者的粪便进行宏基因组测序分析，鉴定了代表183个科和119个属的415种微生物物种。香农和辛普森多样性指数在两组中几乎没有受到HSK31679治疗的影响（图S3A和B）。相比之下，PCA评分和NMDS均显示了HSK31679处理14 d后肠道微生物群β多样性谱的显著变化。对51个不同的细菌属进行属级微生物Spearman相关网络分析，发现HSK31679处理后有几个属与拟杆菌属呈正相关（图S3D）。

随后通过LEfSe分析探索了HSK31679治疗组14天与安慰剂组相比的肠道菌群差异，这进一步揭示了杆菌属的最大增量（图2B，C）。值得注意的是，在第14天上升剂量为80mg、120mg、160mg HSK31679后，B. thetaiotaomicron的相对丰度表现出最明显的逐渐上升（图2C），并通过qPCR进行了验证（图2D），这表明B.thetaiotaomicron可能在HSK31679治疗期间发挥关键中介作用。KEGG通路分析富集了20个信号通路的154个功能基因，其中神经酰胺代谢被HSK31679处理激活（图2E）。这些显著的成分变化与以前对晚期脂肪性肝炎患者微生物种群负相关的研究一致。

3.HSK31679 治疗抑制了?B. thetaiotaomicron?产生的鞘脂类物质的单糖基化过程

基于 B. thetaiotaomicron?的 SLs 可以转移以调节肝脏脂肪变性这一认识，随后研究者试图确定 HSK31679 314 治疗是否已深入调节 SLs 表型。对接受多次递增剂量 HSK31679 316 和安慰剂治疗的参与者的粪便代谢物进行脂质组学分析，发现?HSK31679 治疗显著降低了肠道 B. thetaiotaomicron?产生的鞘脂类物质（如 Hex1Cer 和 Hex2Cer）的单糖基化程度。

HSK31679 治疗组的肠道菌群与鞘脂类物质之间存在显著的负相关关系，HSK31679 治疗的综合统计相关性分析证实，拟杆菌和普雷沃氏菌与 C16:0 和 C24:1 酰基链的己糖神经酰胺呈负相关（图 3D）。这表明口服 HSK31679 治疗可抑制微生物对神经酰胺的单糖基化。

4.thetaiotaomicron 的 GCS 活性对 HSK31679 减轻 MASH 的作用至关重要

进一步研究了HSK 31679介导的SLs 单糖基化的潜在机制。通过体外共培养实验和体内无菌小鼠模型，发现 HSK31679 治疗抑制了 B. thetaiotaomicron?的 GCS 活性。在无菌小鼠模型中，B. thetaiotaomicron?GCS 活性缺失的小鼠对 MGL-3196 和 HSK31679 的疗效没有显著差异，而 GCS 活性存在的小鼠对 HSK31679 的疗效显著优于 MGL-3196。HSK31679 与 B. thetaiotaomicron GCS?的结合结构分析表明，HSK31679 通过空间位阻效应抑制了 GCS 的活性。

5.HSK31679治疗的单细胞图谱

为了深入了解肠道微生物GCS在所有免疫细胞群中治疗HSK31679的独特免疫作用，研究者使用基于液滴的单细胞平台（10×Genomics Chromium）进行了单细胞转录组测序（scRNA-seq），分析了来自参与者队列的18个外周血单核细胞（PBMC）样本，包括3个用安慰剂（GH-PL）治疗的粪便来源GCS高活性样本、3个用160 mg HSK31679（GH-HS）治疗的粪便来源GCS高活性样本，和GCS低活性样本（GL-HS）分别在第0天和第14天。从GH-PL、GH-HS、GL-HS数据集中获得的128031个细胞中，共鉴定出57个细胞簇。通过SingleR v.1.0获得的基于标记的注释，定义了四种主要的细胞类型：T细胞、自然杀伤细胞（NK）和B细胞、髓系细胞、内皮细胞（EC）和间充质细胞（图5B）。通过计算观察到的细胞数与预期细胞数的比值（Ro/e）来量化主要细胞团相对不同的富集情况，发现髓系细胞团构成了GH-HS的主要改变的细胞成分，B细胞、EC团主导了GL-HS样本的细胞成分（图5C、D和图S8C）。鉴于如上所述，HSK31679治疗通过B.thetaiotaomicron的GCS减轻了脂肪性肝炎，在随后分析GH-HS和GL-HS之间的特定细胞区室时重点研究了髓系细胞。

6.HSK31679 治疗重塑了髓系细胞的动态变化，使其趋向于抗炎微环境

在所有髓系细胞亚群中，树突状细胞 (DC) 和巨噬细胞 (Mφ) 构成了主要细胞类型（图 5B）。通过无监督聚类，首先关注 DCs 群体的内在属性和潜在功能，这些 DCs 群体被确定为减少的 CD8α+DCs（图 6A、D）。值得注意的是，GH-HS 组中 Tregs 的 IL-12Rβ2 可以与 CD8α+DCs 衍生的 IL-35 相互作用（图 6B、C）。如先前报道的那样，可以增强炎症过程的抑制功能。与GL-HS或GH-PL数据集相比，GH-HS的PBMCs中CD4+Foxp3+Tregs的数量增加（图6D）。这些Tregs的抑制功能阻断了IL-35的EBI3亚基的作用（图6E），导致免疫原性显著受损。这可能是由于STAT1/STAT3的异常激活和p38 MAPK/NF-κB信号通路的抑制（图S8D和E）。此外，注意到DC簇的分布与γ-谷氨酰转移酶（GGT）的表达相关（图6B），GGT是MASH进展的公认血清生物标志物。在GH-HS的所有DC中（图6A），GGT+样本中CD1C+DCs（cDC2）的比例显著增加，而与GL-HS或GH-PL组相比，DEC205+DCs（cDC1）的比例降低。尽管之前的研究报告了cDCs在促进或抑制脂肪性肝炎中的不确定作用，但结果表明，cDC1和cDC2细胞对HSK31679治疗的反应方式相反。

对于巨噬细胞部分，通过无监督聚类产生了6个具有不同基因特征的聚类。对两个富含非经典单核细胞簇的PBMCs进行了表征：MINCLE+Mφ和S1PR2+Mφ。根据常规表型标记物（TREM2+、MRC1+、CD163+、AGR1+）的高表达，其余簇均被鉴定为巨噬细胞（图6A）。值得注意的是，巨噬细胞簇MINCLE+Mφ、S1PR2+Mφ和AGR1+Mφ显示出相对不同的发展（图6F、G）。在这些巨噬细胞簇中，AGR1+Mφ和MINCLE+Mφ是GH-HS和GL-HS组中改变的主要亚群，而S1PR2+Mφ在GH-HS组更具特征（图5C）。然后研究了它们的不同功能状态，并观察到趋化因子（CCL3/15和CXCL10/12/14）在GH-HS中的表达降低，但在GL-HS样本中没有，这表明其是由这些Mφ簇募集T细胞的过程。GH-HS样本的细胞相互作用分析也证实，抗炎巨噬细胞通过CCL3/15-CCR5、CXCL10/11-CXCR5和CXCL12/14-CXCR4信号传导积极参与T细胞的募集（图6C和S9B）。在GL-HS组中，MRC1+Mφ表达的CCL15/CXCL10水平升高，AGR1+Mφ高度表达CCL2/CXCL12（图S9B）；而GH-HS组CCL22簇的优势Mφ从MINCLE+Mφ切换（图6H和S9D），其AGR1+Mφ上调了RPS27、CDKN1C和KLRF1的表达水平（图S10B），表明经HSK31679处理的粪便来源GCS+参与者的巨噬细胞发生了重编程。总结HSK31679治疗的上述代谢指标，GCS活性和粪便中B.thetaiotaomicron的相对丰度与肝脏ΔTG、ΔTC和ΔGGT水平等呈显著负相关（图6I）。这些结果表明，B.thetaiotaomitron介导的免疫抑制的GCS活性可能预测HSK31679治疗个体的MASH缓解。

研究总结

该研究描绘了HSK31679通过抑制肠道微生物鞘脂的单糖基化来改善MASH的新图谱。这项研究为肠道微生物和循环免疫因素提供了新的见解，这些因素可以作为MASH患者HSK31679治疗的预后标志物，以及基于肠道微生物群的MASLD治疗的新靶点或策略。对于甲状腺模拟物的进一步4期上市后研究，应系统地调查大规模队列，研究抗菌组合对MASH个体长期结果的影响。

文章亮点

该研究证明了肠道微生物在 THR-β 激动剂治疗 MASH 中的重要作用。发现 HSK31679 通过抑制肠道 B. thetaiotaomicron?产生的鞘脂类物质的单糖基化过程来减轻 MASH。揭示了肠道 GCS 活性可以作为 HSK31679 治疗 MASH 的预测生物标志物。发现 HSK31679 治疗重塑了髓系细胞的动态变化，使其趋向于抗炎微环境。

参考文献：

Zhang YH, Xie R, Dai CS, et al. Thyroid hormone receptor-beta agonist HSK31679 alleviates MASLD by modulating gut microbial sphingolipids. J Hepatol.?Published online August 22, 2024. doi:10.1016/j.jhep.2024.08.008