单细胞测序中，从样本制备到文库测序要经过5个技术流程：单细胞悬液制备、单细胞精准捕获&cDNA扩增、文库构建、上机测序、以及数据分析步骤。上期分享了单细胞测序1丨单细胞悬浮液制备，主要介绍了从动物组织、血液、植物组织三种样本中获取单细胞悬浮液的基本方法和注意事项。接下来分享：如何精准捕获单细胞&cDNA扩增等。

目前常见的捕获单细胞技术方法有：微流控和微孔板法。本文通过基于微流控法的平台-百创DG1000来精准捕获细胞，并进行后续的逆转录、cDNA合成与扩增、文库构建等实验，从而获得每个细胞的转录组信息。

1、芯片加样

处理好的细胞悬液尽量在30min以内上机实验，长时间放置，会导致细胞活性降低。按照一定的加样顺序，分别将细胞相、胶珠相（DG1000-3′ gel beads）、油相加入到芯片（图1:左图）对应孔中，然后将芯片放入到百创DG1000微液滴生成仪中（图1:右图），启动开关。

2、形成GEMs

仪器运行后，通过控制流速的方法，使得在“Y型”接口处，一个胶珠会吸附单个细胞及逆转录预混液一起向右流动。到了“十字”接口处，它们与油相接触后，每一个油滴中会包裹着一个胶珠与一个细胞，也就是“油包水”（GEMs）结构。

引物结构

• 百创DG1000-3′ gel beads（胶珠）上固定的引物由4部分组成 ：Read1、Cell Barcode、UMI、Poly(dT)VN。
• Read 1: 是一段已知的短核昔酸序列,主要用于后续的上机测序
• Cell Barcode：片段长度54bp，种类约为88万种，一个胶珠对应于一个特异Cell Barcode序列。
• UMI：在 mRNA反转录后，每一个mRNA随机连上一个UMI，可以通过计数不同的UMI，最终确定mRNA的数量。
• Polv(dT)VN:与mRNA3’端的poly(A)结合,进行后续的逆转录反应

3、cDNA生成与扩增

GEMs形成后，细胞裂解释放出mRNA；同时胶珠也会自动溶解，释放出大量含有Barcode序列的引物，并利用引物末端的Ploy(dT)VN序列捕获液滴中的mRNA，并在一个个GEM中独立完成mRNA逆转录，产生带有Barcode和UMI信息的cDNA。随后“油包水”结构裂开，进行cDNA扩增。

将扩增得到的cDNA纯化后，可用于后续构建测序文库。由于每一个单细胞的cDNA文库标记上了细胞条形码（Barcode）。测序时，就把携带相同Barcode的序列视为来自同一个细胞，达到区分细胞的目的。

以上就是生成GEMs、mRNA逆转录、以及cDNA合成与扩增的全部内容。下期会具体介绍数据分析指标的意义。

单细胞平台-百创DG1000

百创DG1000是基于微流控、油滴包裹和Barcode标记等技术来实现高通量的单细胞精准捕获。除了仪器以外，百创DG1000还有配套的2×4的独立芯片及配套试剂盒。

百创DG1000部分数据展示

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