空间组学技术正在广泛应用肿瘤微环境分析，高通量高分辨率空间转录组技术如何在单细胞分辨率维度剖析肿瘤细胞与免疫细胞在空间位置上真实互作？今天小编给大家带来北京大学第一医院的张宁、李航及北京大学-云南白药国际医学中心薛瑞栋团队合作于2024年5月在Cancer Cell在线发表题为《Integrative molecular and spatial analysis reveals evolutionary dynamics and tumor-immune interplay of?in situ?and invasive acral melanoma》的研究论文，利用多组学技术解析原位肢端型黑色素瘤到侵袭性肿瘤的克隆演变规律，并高精度揭示了APOE⁺/CD163⁺巨噬细胞的空间富集状态和EMT肿瘤细胞的互作，发现APOE和CD163可用于预测iAM的预后，为肢端型黑色素瘤的早期诊断和临床诊疗提供了重要依据。

文章标题：Integrative molecular and spatial analysis reveals evolutionary dynamics and tumor-immune interplay of?in situ?and invasive acral melanoma

期刊名称：Cancer Cell

影响因子：50.3

合作单位：北京大学第一医院、北京大学-云南白药国际医学研究中心

研究方法：全外显子组、基于显微切割的多区域全外显子测序、bulk转录组、单细胞转录组、空间转录组和CODEX空间蛋白组学

百迈客生物为该研究提供了BMKMANU S1000空间转录组细胞分割技术服务。

研究背景

肢端型黑色素瘤（acral melanoma, AM）是一种起源于手掌、足底和甲下等部位的恶性皮肤肿瘤，也是亚洲人群中最主要的黑色素瘤亚型，常发生转移且预后不佳。原位AM（AM in situ, AMis）经手术切除后极少复发，但侵袭性AM（invasive AM, iAM）的预后不佳，且PD-1单抗治疗响应率仅约20%-30%，缺乏有效的治疗策略。因此，AMis突破基底膜进入真皮发展为iAM是造成患者预后变差的重要里程碑事件。然而，目前关于AMis的研究仍然十分有限，AMis向iAM的演化过程尚不清楚，免疫微环境在这一过程中发挥的作用也不明确。AM的早期发现和预防可以显著提高病人预后和治疗。

材料方法

研究材料：

287例肢端型黑色素瘤（AM）患者，146例原位AM（AMis）和141例侵袭性AM（iAM），其中测序队列（147例，其中56例AMis和91例iAM）和验证队列（140例，验证所鉴定出的标志物和临床相关性）。

验证实验：流式分选巨噬细胞（AM患者肿瘤组织和配对外周血，n=4）；健康供体外周血单核细胞和 LM-MEL-45肿瘤细胞系C.M.共培养（0、3、5、7、10、14天，n=3）；流式分选C3患者和非C3患者EMT肿瘤细胞（n=4）；APOE⁺/CD163⁺巨噬细胞和肿瘤细胞共培养体系（n=3）；LM-MEL-45肿瘤细胞系：野生型和IGF1R KO，IGF1抑制剂处理（xentuzumab），IGF1R抑制剂处理（linsitinib）

研究方法：

全外显子组测序（n=92）、基于显微切割的多区域全外显子测序（n=33）、bulk转录组（n=81）、单细胞转录组（scRNA-seq，n=24）、空间转录组（BMKMANU S1000，n=10）空间蛋白组学（CODEX，n=12）。

研究结果

1.研究队列信息和基因组图谱

为了探究肢端型黑色素瘤的演化规律及免疫微环境在其中的作用，研究人员建立了一个287例患者的队列，包含146例AMis和141例iAM，为研究AMis到iAM的演化过程提供了丰富的资源。研究人员将所有患者分为测序队列（147例）和验证队列（140例），测序队列包括56个AMis患者和91个iAM患者。

对测序队列进行了多组学测序，包括全外显子组、基于显微切割的多区域全外显子测序、bulk转录组、单细胞转录组、空间转录组和CODEX空间蛋白组学，而验证队列用于验证所鉴定出的标志物的临床相关性。

全外显子组测序平均覆盖度为313X，基因组图谱显示本研究队列的肿瘤突变负荷（TMB）与以前的AM研究相比较，高于UM组，低于CM组。本研究数据验证了之前报道22q11.21扩增与AM预后相关，说明了本研究队列的高质量，能够对AM侵袭进行深入分析。

2.AMis和iAM的基因组比较确定了侵袭驱动因素

为了确定AM垂直侵袭的驱动机制，研究人员首先描绘了AMis和iAM的基因组图谱，并系统比较了两者的点突变、拷贝数变异、突变负荷、突变印记、亚克隆突变及基因组不稳定性。分析结果表明iAM的亚克隆突变比例和基因组不稳定性显著升高。这种高度的基因组不稳定性可能会加速肿瘤的发生并有助于获得侵袭驱动突变。

值得注意的是，研究人员发现驱动突变（NRAS, KRAS, NF1, KIT）在iAM中显著富集，并在体外实验中验证了这些驱动突变可以增强肢端型黑色素瘤的侵袭能力。这些结果表明AM侵袭高度依赖于获得某些驱动突变，而不是简单地积累更多的突变。

AMis和iAM的转录组学比较显示在iAM中富集细胞外基质(ECM)组织、EMT、KRAS、巨噬细胞迁移和干扰素γ (IFNγ)?通路，暗示AM侵袭期间TME失调。总的来说，驱动突变、基因组不稳定性和TME改变共同作用有助于AM侵袭。另外，研究人员还发现附属器受累也与AMis的驱动突变及侵袭能力密切相关。

3.早期AM的演化克隆过程

本文利用LCM技术探讨患者内部垂直侵袭和区域扩张的进化动态。首先比较了AMis、Syn_AMis和Syn_iAM三种不同类型病变的基因组图谱，在5例表现出侵袭驱动基因的患者中发现配对的Syn-AMis和Syn-iAM共有突变，但是在纯AMis中没有检测到。这个结果表明在垂直侵袭之前就已经获得了侵袭驱动突变，进一步证实了它们在AM侵袭中的驱动作用，这些结果也证实之前提到的基因组不稳定性有助于AM侵袭。进一步探索垂直侵袭起源，研究结果表明，在垂直侵袭阶段，AMis在演化早期获得驱动突变并迅速穿过基底膜，以单克隆播散到真皮中。

为了探究区域扩张的演化模式，通过肿瘤细胞分数?(CCF)推测其克隆组成分析发现不同患者中存在两种不同的扩张模式：（1）CE，克隆扩张，即肿瘤细胞保持单一克隆结构进行均质扩张；（2）SD，亚克隆分化，即肿瘤细胞在增殖过程中获得亚克隆，导致肿瘤异质性升高。

4.多组学分析确定AM三种分子亚型

为了进一步了解AM分子亚型，本文利用bulk RNA-seq对81名患者进行检测，确定C1、C2、C3三种分子亚型。C1亚型作为“角蛋白”亚型，C2亚型提示“染色质重塑”表型，C3亚型表现出“增殖”表型。C3亚型亚克隆突变比例最高，且预后最差。其中C1和C2是均匀混合AMis和iAM，C3亚型高度富集iAM，表明iAM是一个独特的子集。与非C3 iAM（C1和C2 iAM）相比较，C3 iAM表现为PFS缩短和明显的恶性现象类型，尤其值得注意的是C3 iAM表现出显著性更多的亚克隆突变。同时发现C3亚型表现出较高水平的免疫浸润、肿瘤相关巨噬细胞(TAM)和EMT，而通过这三种AM分子亚型来看肿瘤负荷与TAM评分是相互独立的。相比之下，TAM评分与基因组不稳定性相关，包括wGII和CNH-DNA评分以及亚克隆突变。此外, TAM评分与EMT评分相关和预后差。这些结果共同表明TAM的浸润可能会促进C3的肿瘤EMT和基因组不稳定性并导致预后不良。

5.scRNA-seq鉴定APOE⁺/CD163⁺巨噬细胞亚群

为了在单细胞水平研究肿瘤和TME细胞异质性，利用单细胞转录组技术对8个AMis?和16个iAM进行检测，一共获得223023个细胞，聚类分为13个细胞群。并针对巨噬细胞进行亚群分析，鉴定5种亚群，包括Mph_APOE_CD163，Mph_APOE, Mph_CD163， Mph_ISG15，和Mph_TIMP1。分析显示Mph_APOE_CD163、Mph_CD163和Mph_APOE 均为免疫抑制TAM，因此统称为?APOE⁺/CD163⁺ TAM。研究发现这类巨噬细胞在C3亚型中显著富集，且浸润程度与肿瘤EMT分数正相关。配体-受体分析表明，巨噬细胞表现出最丰富的细胞间相互作用。

6.空间转录组学分析证实了APOE⁺/CD163⁺ TAM与EMT肿瘤细胞之间的直接接触和密切相互作用

为了探索APOE⁺/CD163⁺ TAM与EMT高水平的肿瘤细胞相关作用，通过空间转录组测序技术（ST，BMKMANU S1000）检测10个AM样品。结果可清晰观察到肿瘤组织多层结构，包括表皮层：基层、棘层和颗粒层、以及分泌汗腺的皮下结构和血管。在C3 iAM患者中，肿瘤区域富集大量的EMT高水平的肿瘤细胞，同时也高度浸润了APOE⁺/CD163⁺ TAM，而在非C3患者中无法发现这种共存。正如预期的那样，C3患者表现出EMT肿瘤细胞比例明显较高，并且APOE⁺/CD163⁺ TAM水平增高。C3患者中，在空间位置上APOE⁺/CD163⁺ TAM更接近EMT肿瘤细胞。CellChat分析显示APOE⁺/CD163⁺ TAM作为信号发送者(配体)和接收着（受体）均表现出高活性，证实了其具有细胞与细胞强互作。与其他免疫细胞相比，APOE⁺/CD163⁺ TAM表现出最高水平的胰岛素生长因子(IGF)信号网络的发送细胞和接收细胞，这些结果揭示APOE⁺/CD163⁺ TAM和EMT肿瘤细胞在空间上的直接接触和密切相互作用。

文中如何在空间上实现单细胞分辨率EMT肿瘤细胞和非EMT肿瘤细胞的详细注释呢？

研究者利用高分辨空间转录组技术结合细胞分割方法定位到肿瘤EMT状态的细胞被定义为EMT肿瘤细胞，而非EMT肿瘤细胞被映射到其他肿瘤状态。

7.多重空间蛋白质组学验证了APOE⁺/CD163⁺ TAM与EMT肿瘤细胞之间的相互作用

进一步验证APOE⁺/CD163⁺?TAM和EMT肿瘤细胞在蛋白水平上的空间分布和相互作用，文中对12个AM样本进行了空间蛋白组检测（22 plex CODEX）。其中C3患者以EMT肿瘤区域为主，非C3患者以非EMT肿瘤区域为主，结果表明APOE⁺/CD163⁺ TAM与EMT肿瘤细胞呈正相关。在C3患者中，IGF1和IGF1R的表达水平均显著升高。APOE⁺/CD163⁺ TAM高度富集在EMT^high区域。同时IGF1和IGF1R在EMT^high区域也显著升高。这些结果在单细胞水平和空间水平均支持APOE⁺/CD163^+?TAM可能通过IGF1-IGF1R相互作用促进肿瘤细胞的EMT。

8.实验验证APOE⁺/CD163⁺ TAM通过IGF1-IGF1R相互作用促进肿瘤细胞的EMT

流式分选患者肿瘤组织和配对外周血APOE⁺/CD163⁺ TAM，蛋白水平可以检测到APOE⁺/CD163⁺ TAM的表达，同时AM细胞可以诱导APOE⁺/CD163⁺ TAM表型。离体分析证实C3患者的EMT肿瘤细胞的比例明显高于非C3患者，ELISA分析显示，与APOE⁺/CD163⁺ TAM共培养后，IGF1蛋白的分泌持续升高，而IGF1抑制剂、IGF1R抑制剂及敲除肿瘤的IGF1R均可以抑制这一过程，这些结果表明APOE⁺/CD163⁺ TAM可以通过IGF1-IGF1R相互作用促进肿瘤细胞的EMT。研究人员还在两个独立队列中验证了APOE和CD163染色可用于预测AM的预后。

研究总结

综上所述，本研究基于多组学测序，系统揭示了早期肢端型黑色素瘤的克隆演化规律，建立了肢端型黑色素瘤的分子分型，解析了肿瘤细胞-免疫细胞的空间互作关系，鉴定出新的早期诊断标志物（驱动突变和附属器受累）及晚期预后标志物（APOE和CD163），为肢端型黑色素瘤的早期诊断和精准诊疗提供了重要信息。

北京大学第一医院的张宁教授、李航教授和北京大学-云南白药国际医学研究中心的薛瑞栋研究员（北京大学第一医院兼职教授）为共同通讯作者。北京大学-云南白药国际医学研究中心刘恒康博士后、北京大学第一医院皮肤性病科高嘉雯博士和北京大学第一医院肿瘤转化研究中心冯梅博士后为共同第一作者。

参考文献：

Liu et al., Integrative molecular and spatial analysis reveals evolutionary dynamics and tumor-immune interplay of?in situ?and invasive acral melanoma,?Cancer Cell?(2024), https://doi.org/10.1016/j.ccell.2024.04.012

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