中文标题:?揭示铝对苦草叶附着生物膜微生物群落演替的生态机制：微生物相互作用的新见解

英文标题:?Unraveling the ecological mechanisms of Aluminum on microbial community succession in epiphytic biofilms on?Vallisneria natans?leaves: Novel insights from microbial interactions

期刊名称：Journal of Hazardous Materials

影响因子：13.6

合作单位：淡水生态与生物技术国家重点实验室（中国科学院水生生物研究所）

研究对象：苦草叶片附着生物膜

测序技术：二代微生物多样性（16s/18s）

百迈客生物在该研究中提供了二代微生物多样性（16s/18s）技术服务。

研究背景

苦草是一种广泛分布在我国淡水水体中的多年生沉水植物，它经常被用作水生态恢复的先锋物种。在此背景下，重点研究了不同浓度铝（Al）暴露下，苦草叶片附着生物膜中的微生物群落特征和微生物食物网的响应。该研究假设如下：(1)?暴露于Al会引起苦草叶片附着生物膜形态特征的改变，同时影响这些生物膜内细菌和微型真核生物的组成和多样性；(2) Al暴露会导致附着生物膜内微生物共现网络的复杂性和稳定性发生变化，从而重塑生物膜内微生物之间的相互作用；(3)为响应Al暴露，苦草可能表现出生理适应性。

该研究旨在解析Al对沉水植物和微生物群落的毒性作用，强调在水生生态系统中控制适当的Al浓度对保护微生物多样性、维持生态功能和加强湖泊修复重要作用。

材料方法

基于16s rRNA基因及18s rRNA基因测序分析不同浓度Al暴露后苦草叶附着生物膜的细菌和微型真核生物组成。

研究结果

1.苦草叶片附着生物膜的结构特征

随着Al浓度的升高，叶片上的生物膜聚集情况逐渐增加。利用多重荧光染色和CLSM，我们观察了Al处理下生物膜组分的不同性质，注意到核酸浓度在1.2 mg/L组达到峰值(图1c)。藻类密度和附着生物膜厚度随Al浓度的增加而增加，1.2 mg/L组最大厚度为101.94μm，CK组为34.50μm(图1e)。结果表明，铝处理促进了苦草附着生物膜的生长。所观察到的现象可能归因于Al离子分散到水生环境中，随后与水体中的氮和磷形成聚集体。这些聚集体通过沉降作用积聚在沉水植物叶片表面，增加附着生物膜内的氮和磷含量，促进附着微生物的生长。

图1-附着微生物在苦草叶片上的空间分布的CLSM 3D图像（a-d）和生物膜的厚度（e）。生物膜被染色具有蓝色（核酸）、绿色（胞外多糖）和红色（叶绿体）

2.附着生物膜中细菌多样性和丰度的变化

利用Shannon指数和Chao1指数对附着生物膜的细菌群落复杂性进行了评价：

第7天，Shannon多样性指数为5.62~6.21，各组间差异不显著(P>0.05)。而1.2 mg/L浓度组的Chao1指数(770.86±23.46)显著高于对照组，表明物种丰富度增加(图2a)；

第14天，CK和0.6 mg/L组的Shannon多样性均高于1.2和2.0 mg/L组(图2a)，处理间Chao1指数无显著变化(图2b, P>0.05)；

在第21天，2.0 mg/L组的Shannon和Chao1指数显著降低，表明Al胁迫导致多样性和丰富度降低(图2a、2b；P<0.05)。

这种影响可归因于高Al水平对细菌细胞的有害影响，包括细胞裂解，DNA降解，代谢酶活性的破坏，损伤细胞膜通透性，以及通过消除敏感物种而导致的细菌群落多样性的减少。采用PCoA观察不同浓度铝对附着生物膜细菌群落的影响，结果表明，在每个采样时间点(第7天、第14天、第21天)，PCoA分别占细菌群落方差的52.6%、71.94%和75.85%(图2d、2e、2f)。0.6 mg/L处理与CK处理第7天细菌群落结构比较相似。暴露21天后，四个处理组间差异明显，说明Al暴露显著改变了细菌群落组成(P<0.05；图2d)。

图2-暴露7天、14天和21天的样品中附着生物膜中细菌群落的Shannon指数（a）和Chao 1指数（b），不同的字母表示四种处理之间的显著差异（P < 0.05）。数据表示平均值± S.E（n=3）。（c），（d）和（e）是分别暴露7天、14天和21天细菌群落的β多样性，由PCoA基于Bray-Curtis差异显示。

门水平的细菌群落组成结果显示了微生物群落对Al暴露的动态响应(图3a)。变形菌门(28.64% ~ 68.58%)、蓝细菌门(14.15% ~ 43.74%)、厚壁菌门(0.48% ~ 33.24%)和拟杆菌门(2.10% ~ 15.60%)是所有附着生物膜样品中的优势菌群，广泛存在于苦草叶片的附着生物膜。同时，变形菌门和拟杆菌门在各处理组中均占优势地位。然而，在浓度分别为1.2 mg/L和2.0 mg/L的Al处理21天后，两个门的相对丰度均显著低于CK组，说明这些细菌的增殖受到了Al暴露的影响。

总的来说，Al暴露确实改变了细菌群落的多样性和组成，从而影响了苦草上附着生物膜降解污染物的生态功能。属水平上优势属依次为uncultured_bacterium_f_burkholderaceae(5.21 ~ 18.32%)、Exiguobacterium?(0.06 ~ 32.48%)、Limnobacter(1.83 ~ 28.81%)、Limnothrix(0.25 ~ 24.56%)、Zavarzinia(0.49 ~ 14.53%)、Schizothrix_LEGE_07164?(0.86 ~ 8.69%)、Pseudanabaena_PCC-7429(0.23 ~ 6.65%)。在实验的第14天和第21天，各处理组的Exiguobacterium细菌丰度均显著增加。相反，burkholderaceae, Limnobacter和Zavarzinia表现出相反的趋势，它们的丰度随着处理时间的推移而减少(图3b)。

图3-每个生物膜样品中相对丰度最高的十个细菌门（a）和属（b）。D7、D14和D21表示第7天、第14天和第21天。圆圈（b）与所有样本中每个属的相对丰度成比例。

3.附着生物膜中微型真核生物多样性和相对丰度的变化

微型真核生物群落在水生生态系统中发挥着至关重要的作用，特别是在附着生物膜中，它们占据着专门的生态位。尽管它们具有重要的生态学意义，但我们对沉水植物附着生物膜中的微型真核生物群落多样性和组成的了解仍然有限，特别是在Al暴露下。本研究以18s rRNA基因测序为基础，利用Chao1指数和Shannon指数对微型真核生物群落的多样性进行了评价。实验第7天，Shannon指数和Chao1指数分别为5.41 ~ 5.79和321.04 ~ 346.47，各组间差异不显著(图4a、4b)。第14天，CK组Shannon指数(4.76±0.24)显著低于其他处理组(图4a、4b, P < 0.05)。随着时间的推移(第21天)，0.6、1.2和2.0 mg/L处理的Shannon指数分别为4.84±0.24、4.59±0.30和4.57±0.21，显著高于CK组(3.96±0.12)(图4a、4b, P < 0.05)。此外，利用PCoA分析，我们确定了微型真核生物群落结构的显著时间演替模式，在实验期间，处理组和CK组之间的β多样性存在显著差异。

图4-暴露7天、14天和21天的样品中附着生物膜中微型真核生物群落的Shannon指数（a）和Chao 1指数（b），不同的字母表示四种处理之间的显著差异（P < 0.05）。数据表示平均值± S.E（n=3）。（c），（d）和（e）是分别暴露7天、14天和21天细菌群落的β多样性，由PCoA基于Bray-Curtis差异显示。

根据注释结果，在所有样本中鉴定出10个优势的微型真核生物门，分别是Chlorophyta(8.71–34.25%)，Intramacronucleata (10.69–30.43%)，Diatomea (2.11–30.24%), Platyhelminthes (0.02–22.00%)，Annelida (0.04–20.60%), Cryptomycota (0.21–11.99%)， Streptophyta (1.84–8.37%)，Rotifera (0.52–7.23%)，Cercozoa (0.91–6.45%)，Chytridiomycota (0.07–6.42%) (图5a)。值得注意的是，在处理组中Rotifers的丰度显著增加(图5a)。在实验后期，尤其是处理组，Platyhelminthes 和 Annelida的相对丰度有所增加(图5a)。

如图5b所示，微型真核生物属相对丰度前10位依次为Cocconeis?(1.18-28.89%)、VorticellaDaphnia_pulex?(3.93-22.79%)、Oedogonium?(3.46-20.48%)、Gieysztoria(0.01-19.52%)、Coleochaete(1.80-8.31%)、Stenostomum(0-5.93%)、Spathidiopsis(0.01-10.55%)、Ptygura(0.17-2.68%)、Choanocystis(0.06-4.83%)、Vorticella(0.21-3.05%)。Al离子干扰硅藻体中二氧化硅的溶解被认为是一种潜在的机制。这种干扰影响了硅藻细胞的分裂和生长，这可能解释了0.6 mg/L和1.2 mg/L Al处理组硅藻(Cocconeis)丰度低于CK组的原因。

图5-每个生物膜样品中相对丰度最高的十个微型真核生物门（a）和属（b）。D7、D14和D21表示第7天、第14天和第21天。圆圈（b）与所有样本中每个属的相对丰度成比例。

4.细菌和微型真核生物群落的组装和共生模式

一般来说，微生物群落的聚集受到确定性和随机过程的影响。对于细菌群落的聚集，异质性选择的生态过程是主要的确定性过程，而均匀化扩散则贡献了大部分的随机过程(图6a, 6c)。值得注意的是，确定性过程对细菌群落的影响从CK组的44.4%增加到2.0 mg/L Al处理组的55.5%，这表明Al暴露加剧了选择压力，从而降低了随机性在群落聚集中的作用。猜测可能与营养无关的干扰增强了生态位选择，减少了优先效应，导致随机过程的影响降低。随着Al浓度的增加，微型真核生物群落组装的确定性过程从CK组的8.3%增加到2.0 mg/L组的13.8%。表明在微型真核生物群落的组装过程中，随机过程比确定性过程发挥更重要的作用(图6b、6d)。在随机过程中，homogenizing dispersal过程(44.4%、47.2%、52.7%和38.8%)是微型真核生物群落组装过程中最关键的过程，其次是undominated过程(图6b、6d)。NCM进一步量化了中性理论的贡献，确定了在预测的随机分布范围内。这些分析强调，确定性和随机过程都协调了附着生物膜中微生物群落的组装。对Al胁迫的反应，细菌群落表现得比微型真核生物群落的更明显的反应。这种不同的敏感性可能源于微型真核生物更大的细胞复杂性和功能多样性，从而增强了生态位适应能力，减轻了选择压力下环境过滤的影响。

Al处理组(1.2 mg/L和2.0 mg/L)细菌共现网络的平均程度、边数和网络密度高于CK组。表明Al处理增强了细菌网络的复杂性。在微型真核生物群落共现网络中观察到相反的模式。其中，平均程度、边数和网络密度CK均高于处理组。表明Al处理降低了微型真核生物网络的复杂性，微生物物种之间的相互关系相对稀疏。

微生物之间相互作用复杂性的增加有助于提高它们之间物质交换的效率，并增强对外部压力的抵抗力。在Al处理组中观察到的微型真核生物网络复杂性的降低，表明微型真核生物群落的稳定性降低，其对外部压力源的恢复能力降低。暴露于Al后，细菌网络中正边的比例降低，而微型真核生物网络中正边的比例增加，与细菌群落相比，Al处理组的微型真核生物群落的合作水平更高。

图6-不同处理组中细菌（a）和微型真核生物（b）的βNTI分布。细菌（c）和微型真核生物（d）群落组装的周转百分比主要由不同的随机过程（dispersal limitation and homogenizing dispersal）和确定性过程（homogeneous selection）决定，以及处理中不受任何单一过程（Undominated）控制的百分比。

5.关键类群的生态网络分析及其相互作用模式的差异

探索复杂多样的微生物群落中的相互作用模式可以为研究Al胁迫如何影响微生物群落动态提供新的见解。CK、0.6 mg/L、1.2 mg/L和2.0 mg/L处理组的边分别为204、284、256和319(表1)，表明处理组细菌与微型真核生物之间的相互作用更为复杂，可能提高附着生物膜系统的复杂性。总体而言，共发生网络复杂性随着Al浓度的升高而上升，可能是Al胁迫下微生物群落的生存机制。

表1-不同处理组的微生物群落网络的基本性质

随着Al浓度的增加，微生物群落间正相关比例从49.51% (0 mg/L)上升到57.05% (2.0 mg/L)，负相关比例从50.49% (0 mg/L)下降到42.95% (2.0 mg/L)(表1)。正相关可能代表了相互共生和捕食，负相关反映了资源竞争。由此可以推断，在Al暴露压力下，微生物群落的成员表现出更多的合作或捕食。根据摄食模式，附着生物膜食物网被分为三个营养水平：初级生产者(藻类和蓝藻)、消费者(后生动物和原生动物)和分解者(细菌和真菌)。Keystone类群在微生物共生网络中起着重要作用，其变化可导致微生物群落结构和功能的变化。CK组的重点分类群包括Methylomultilis、Nevskia、Caulobacter、Methylophilus、Cocconeis、Chlorochytrium、Oedogonium等(图7a)。同样，在0.6 mg/L处理组，主要分类群包括Zavarzinia, Nevskia, Methylophilus, Caulobacter等(图7b，图S8b)。值得注意的是，Chlorophyta成员Chlorochytrium和Oedogonium与Pseudomonadota和Bacteroidota表现出共生关系，通过光合作用衍生的细胞外基质和养分释放促进细菌定殖。这种藻类和固氮细菌之间的协同作用在维持生物膜群落、促进恢复力和污染物修复效率方面起着关键作用，强调了生物膜生态系统中微生物群落之间错综复杂的相互依赖关系。在1.2 mg/L Al处理组中，观察到Keystone类群由细菌转变为藻类，伴随着分解者和消费者的减少，表明微生物群落的养分去除能力可能会减弱，因为细菌在养分循环和有机物降解中起着至关重要的作用。但其中Cyanobacteriota的Cyanothece_PCC_7425和Pseudanabaena_PCC-7429与其他分类群表现出不利的相互作用，这暗示微囊藻毒素的产生可能抑制竞争微生物的生长。研究结果表明，在1.2 mg/L的Al浓度下，捕食者丰度减少，促进藻类增殖，从而通过破坏捕食动态改变微生物群落组成，强调了自上而下控制附着生物膜微生物群落的重要性。在2.0 mg/L Al处理组中，观察到光合生产者的丰度显著下降，可能是由于Al毒性损害了生物膜内真核藻类的生长(图7d，图S8d)。与对照组相比，该处理显示出独特的关键类群，如Exiguobacterium(Bacillota)、IMCC26134 (Verrucobacterium)和Ptygura (Rotifers)，强调了微生物共生网络中有机物分解和捕食的优势。有研究证明，Exiguobacterium可以在极端环境中生长，并对Cyanobacteriota的物种表现出强大的抑制作用，这可以解释为什么其在2.0 mg/L Al处理组处于优势。

图7-不同处理组附着生物膜中细菌和微型真核生物群落的相关网络图，（a）CK，（b）0.6 mg/L，（c）1.2 mg/L，（d）2.0 mg/L。（圆圈代表物种，同一颜色属于同一门，圆圈的大小代表丰度；线代表两个物种之间的相关性，线的颜色：粉红色代表正相关性，绿色代表负相关性）。

研究总结

本研究为阐明Al对苦草叶片附着生物膜内细菌和微型真核生物群落的影响提供了实验证据。结果表明，Al处理促进了丝状藻的生长，导致附着生物膜厚度增加。高浓度的Al (2.0 mg/L)显著降低细菌多样性，但增强微型真核生物多样性。与微型真核生物相比，Al处理对细菌群落的组装过程影响更为深远。Al的影响扩展到微生物相互作用的动态，表现为共生网络中关键类群组成的变化，并促进微生物之间的合作增加。这种变化可能潜在地破坏附着生物膜的结构和功能完整性。

此外，该研究强调了苦草的适应性策略，特别是其抗氧化反应，作为抗Al诱导的氧化应激的防御机制。这些发现有助于更深入地了解水生环境中不断上升的Al水平所带来的生态风险。此外，他们还为在日益增长的环境压力下有效的湖泊修复工作提供了指导，强调了管理Al浓度以保护微生物多样性和维持生态系统服务的迫切需要。