2024年2月，四川大学华西医院在国际学术期刊ANNALS?of Clinical and Translational Neurology发表一项重要研究成果，题为：Decoding the biology and clinical implication of neutrophils in intracranial aneurysm。使用单细胞 RNA 测序?(scRNA-seq)、RNA-seq 和小鼠模型来剖析在破裂和未破裂的颅内动脉瘤中性粒细胞的功能和临床意义。

文章标题：Decoding the biology and clinical implication of neutrophils in intracranial aneurysm

期刊名称：ANNALS?of Clinical and Translational Neurology

合作单位：四川大学华西医院

研究对象：颅内动脉瘤

研究方法：scRNA-seq、RNA-seq?数据挖掘、小鼠模型等

百迈客为该研究提供了单细胞转录组测序服务。

研究背景

颅内动脉瘤（IA）是一种常见的脑血管疾病，最终可导致毁灭性的出血性中风。据估计，IA 的患病率为 3%-5%，由于人口老龄化和血管造影成像检查的日益普及，这一数字正在增加。大多数 IA 在整个生命周期中保持稳定，而大约 1% 会进展和破裂，导致致命的动脉瘤性蛛网膜下腔出血，此种情况下超过一半的患者死亡和残疾。不稳定的 IA 的特征是动脉瘤体积较大、形状不规则，或者患者存在衰老、高血压或吸烟等各类遗传和环境高危因素。总体而言，目前对不稳定 IA 发生和进展机制的理解还不够充分，这强调了阐明 IA 壁的病理生理学改变和破裂相关的机制的重要性。

实验材料

对多个动脉瘤临床样本和小鼠动脉瘤模型样本进行了单细胞测序。深度分析动脉瘤数据集GSE13353和GSE122897。

1、scRNA-seq

在搭桥手术或夹闭术之前，从经血管造影诊断为未破裂 IA 和动脉瘤 SAH 的患者中收集没有血栓的新鲜 IA 圆顶进行单细胞测序。任何怀疑患有导致血管动脉瘤病变的遗传性疾病的患者均被排除。并取小鼠 IA 模型的脑动脉瘤组织进行单细胞测序。

2、Bulk RNA-seq

深度分析动脉瘤数据集GSE13353和GSE122897。

研究结果

1.IA 组织中中性粒细胞的鉴定

根据之前明确的基因标记，包括FCGR3B、CSF3R、CXCR2和G0S2，总共9025个中性粒细胞被人工分配（图1A–C）。该研究进一步使用 Azimuth 自动注释这些细胞，得到 8435 个中性粒细胞。IA1 是一种破裂的 IA 组织，与其他样本相比，其中性粒细胞数量最多（图1D）。总体而言，IA 破裂时中性粒细胞较多，这可能与 IA 破裂及随后的局部血栓形成有关。值得注意的是，ssGSEA 分析显示，中性粒细胞浸润发生在 IA 破裂阶段。根据中性粒细胞独特表达的标记基因，当 IA 破裂时，IA 形成和中性粒细胞数量增加（图1E）。总之，这些结果强烈表明中性粒细胞参与 IA 进展。

先前的研究表明中性粒细胞的功能和进化具有异质性，而IA穹隆中的中性粒细胞亚群仍然知之甚少。该研究使用“FindClusters”功能以更高分辨率（分辨率?=?0.9）重新聚类中性粒细胞，以识别不同的中性粒细胞群落。结果，鉴定出八个中性粒细胞亚群（C0-C7）（图2A-B）。富集分析揭示了 C1 和 C6 中细胞凋亡途径的正调节富集。具体而言，中性粒细胞胞外池?(NET) 的形成促进 IA 破裂，在 C1 中富集。对应激反应、脱颗粒和 NET 形成在 C8 中丰富，伴侣介导的蛋白质折叠和自噬在 C3 中丰富，表明这些细胞也受到应激。TNF、NF-κB 和中性粒细胞脱粒等通路在 C0、C4、C5 和 C7 中富集，表明这些细胞执行中性粒细胞的促炎功能。此外，还进行了 RNA 速度分析来描绘中性粒细胞亚簇的潜在轨迹。结果，这些细胞形成了包含两个分支的轨迹。C5 和 C6 亚簇可能是轨迹的末端，CR1、MEF2C?和?SYK?参与细胞凋亡（图 2C）。

最近的研究根据中性粒细胞从骨髓到外周血的迁移决定了中性粒细胞的转录组特征，即“中性粒细胞”。该研究基于scRNA-Seq数据集研究了小鼠 IA 模型中性粒细胞浸润到IA组织时是否存在这种转录组特征。结果显示假手术中存在少量中性粒细胞富集，并形成小鼠模型高表达的基因标记，包括Ifitm6、Ltf、Camp?和?Chil3。这些细胞表达较低成熟或老化的基因标记，如Malat1、Msrb1、Il1b和Ccl6（图?3A），表明它们是从外周血新渗入的。执行单片算法来识别细胞进化轨迹，并将这些新渗透的细胞指定为起点（图3B）。根据莫兰斯指数 (morans I) 以及未破裂（假手术）和破裂小鼠模型中的基因表达，该研究计算了 IA 组织中新浸润和老化中性粒细胞的基因特征（图3C）。与之前的研究一致，新浸润的中性粒细胞高表达Cebpe，在粒细胞生成和炎症因子产生中发挥作用，而相对老化的中性粒细胞表达S100a 家族基因和伴侣，如?Hspa1b、Has1a1?和?Hsp90aa1，表明压力或衰老状态。富集分析揭示了这些细胞的不同功能，新浸润的中性粒细胞中富集了多种代谢途径，而老化的中性粒细胞则激活了炎症和凋亡相关途径（图3D）。总之，这些结果表明 IA 组织中存在中性粒细胞，并强调了它们的功能异质性。

2.募集中性粒细胞的细胞和细胞因子

在之前的研究中忽略了中性粒细胞向 IA 组织的局部募集，为了填补这一空白，使用 cellphoneDB 算法进行了细胞间通信分析。该研究首先表征了未破裂 IA 组织中参与中性粒细胞募集的细胞和细胞因子。结果显示血管细胞（内皮细胞、SMC 和周细胞）和免疫细胞（单核/巨噬/DC、中性粒细胞、T/B 淋巴细胞和肥大细胞）广泛产生中性粒细胞趋化因子（图4A）。高频趋化因子包括 CXCL2/3/1，它与 CXCR2/1 和 CCR1 等中性粒细胞受体结合（图 4B）。在未破裂的 IA 中，主要参与中性粒细胞募集的细胞是单核细胞/巨噬细胞，包括 Mono.1/2 和 Macro.1/2。在破裂的 IA 中招募中性粒细胞的趋化因子与未破裂的 IA 中的趋化因子表现出相似的模式组成，但对 CXCL3 和 CCL5 的依赖性更高（图 4C,D）。接收这些信号的中性粒细胞受体是保守的（图4D）。

3.中性粒细胞与IA形成和破裂之间的关联

为了研究中性粒细胞浸润的病理意义，该研究首先展示了破裂和未破裂样本中每种类型的中性粒细胞的比例。破裂样本中除 C6 之外的中性粒细胞亚群有所增加（图5A）。该研究进一步整理了这些中性粒细胞的基因特征，发现C0和C5在破裂的IA组织中显着富集（图5B，D）。此外，与正常血管组织相比，未破裂 IA 中的 C0 和 C5 也显着富集，与 C4 和 C8 相同（图5C），表明中性粒细胞参与 IA 形成和破裂。接下来，进行 ROC 分析以评估中性粒细胞亚群与 IA 形成和破裂之间的关联。结果显示C0和C6的ssGSEA评分在预测IA破裂方面产生了令人满意的AUC值（两个数据集中的AUC?>?0.7）（图5E），表明这些细胞可能参与IA破裂。反过来，C4 和 C5 在预测 IA 形成方面表现良好。在此基础上，C0 和 C5 的局部渗透分别是 IA 破裂和形成的有力预测因子。

4.IA穹隆中性粒细胞铁死亡

中性粒细胞介导的炎症对 IA 壁具有破坏性。最近，新出现的证据表明，中性粒细胞在某些情况下对铁死亡敏感，这将进一步促进局部炎症级联反应并促进 IA 进展。在此，该研究描述了 IA 中中性粒细胞与铁死亡之间的潜在关联。该研究根据两个批量转录组数据集计算了 DEG，并注释了铁死亡驱动基因和抑制基因（图 6A,B）。结果显示在破裂的 IA 组织中，几个铁死亡驱动基因和抑制基因有显著差异，表明铁死亡途径失调。破裂的 IA 组织的铁死亡驱动基因 ssGSEA 评分高于未破裂组织，而抑制基因的 ssGSEA 评分相当（图6C），表明铁死亡与 IA 破裂之间存在关联。值得注意的是，未破裂的 IA 组织的铁死亡驱动基因得分高于对照样本，表明铁死亡也可能参与 IA 的形成。多个基因与中性粒细胞铁死亡有关，例如谷胱甘肽过氧化物酶 4(GPX4) 和微粒体谷胱甘肽 S 转移酶 1 (MGST1) 充当铁死亡抑制剂；花生四烯酸脂氧合酶 5(ALOX5)、花生四烯酸脂氧合酶 5 激活蛋白(ALOX5AP)、花生四烯酸脂氧合酶 12(ALOX12)、花生四烯酸脂氧合酶 15(ALOX15) 和前列腺素 2(PTGS2) 充当铁死亡驱动程序。在单细胞分辨率下，中性粒细胞高表达PTGS2和ALOX5AP（图6D），它们与铁死亡显着相关，表明这些细胞参与前列腺素和白三烯的产生，并且对铁死亡敏感。尽管数量较少，但肥大细胞高度表达 ALOX5 和 ALOX12。鉴于白三烯可以通过多细胞协同方式产生，局部白三烯可能是由中性粒细胞和肥大细胞以协同方式产生的。总之，这些结果表明 IA 组织中中性粒细胞的铁死亡可能是由 ALOX5AP 和 PTGS2 驱动的，并且可以由肥大细胞促进。

5.中性粒细胞NETosis

NET 的产生是中性粒细胞导致 IA 破裂的另一种方式，且取决于称为 NETosis 的过程。因此，抑制 NETosis 是 IA 有前景的治疗靶点。然而，由于这些细胞的多功能性，发生 NETosis 的中性粒细胞亚群尚不清楚。作者的结果表明 NETs 形成信号通路在 C1 中富集（图2B）。该研究从京都基因和基因组百科全书 (KEGG) 数据库中收集了人类 NETosis 基因特征，发现 NETosis 的 ssGSEA 评分在 C1 中升高（图7A）。PADI4?的表达对于组蛋白瓜氨酸化至关重要，在 C1 中上调，并表现出正相关的未剪接/剪接 mRNA 比率（图 7B），表明PADI4在驱动C1 NETosis中发挥作用。此外，PADI4的表达与C1中NETosis的ssGSEA评分成正比（图7C），证实C1易于发生NETosis。与其他中性粒细胞相比该中性粒细胞子集专门表达?MNDA?(Pct.1?=?91.8%, Pct.2?=?54.5%),?CREB5?(Pct.1?=?74.7%, Pct.2?= 33.7%) 和?LRKK2?(Pct.1?=?78.4%, Pct.2?=?36.2%) ?(图7D)，因此可以作为抑制 NETs 介导的 IA 进展的目标。

研究总结

该研究使用?scRNA-seq?对脑动脉瘤临床样本和小鼠IA模型样本进行了测序。作者发现未破裂和破裂的?IA?穹顶都含有大量中性粒细胞，以表达FCGR3B、G0S2、CSF3R?和?CXCR2等基因为特征。这些细胞在功能和分化方面表现出异质性。尽管具有相似的基因表达谱，但IA穹顶中的中性粒细胞表达了一系列特征基因并与从骨髓到外周血迁移观察到的转录组学改变相似。此外，未破裂的?IA?中中性粒细胞的募集主要由单核细胞/巨噬细胞介导，一旦破裂，中性粒细胞和炎症平滑肌细胞 （SMC） 的特定亚群都参与该过程。ROC分析表明，不同的中性粒细胞亚簇分别与IA的形成和破裂相关。通过回顾目前的研究，发现中性粒细胞通过特异配体、ALOX5AP?和?PTGS2?驱动的铁死亡，以及?PADI4?介导的NETosis对?IA 壁完整性起着不利作用。